多光子显微镜是一种用于生物和医学研究的先进成像技术，可以对活体组织和细胞进行高分辨率成像。它是荧光显微镜的一种形式，利用了被称为多光子激发的非线性光学过程。

在这个过程中，多光子激发，包括一个荧光体（也被称为氟色素）同时吸收多个低能量的光子，被用来激发分子。作为这种吸收的结果，荧光团经历了一个电子转变，变成了一个激发态，从而产生了上转换的荧光。上转换荧光是指发射比入射光子波长更短的光，这种独特的现象被用来在各种成像技术中捕捉高分辨率的图像。

在单光子激发中，荧光体吸收了一个能量较高的单光子，促进分子从其基态S0到激发态S1。这种能级转换使荧光团能够发出比入射光子更长波长的荧光。另一方面，在双光子激发中，荧光体同时吸收两个具有相同或不同能量的光子。这些光子的综合能量相当于单光子激发所需的能量。因此，荧光体经历了从基态S0到激发态S1的转变，导致发射波长比入射光子短的荧光，发生在从激发态S1返回基态S0的过程中。

双光子和三光子吸收诱导的上转换荧光都常用于多光子显微镜。它们涉及荧光体对多个低能量光子的同时吸收。在双光子吸收中，两个光子几乎同时被吸收，而在多光子吸收中，三个或多个光子被一起吸收。但是，由于三光子吸收的要求很高，需要很高的峰值功率，双光子显微镜已经成为生物成像的主导技术，具有实际的优势。

双光子显微镜

双光子显微镜是多光子显微镜的一种特殊类型，它使用双光子吸收，其中两个光子被用来激发样品中的荧光分子。双光子吸收指的是这样一种现象：通过同时吸收两个相同或不同频率的光子，分子可以从一个较低的能量状态，通常是基态，激发到一个较高的能量状态。这个过程涉及到分子内的电子从一个原子轨道过渡到另一个相对不太稳定的原子轨道。

这两种状态之间的能量差相当于被吸收的两个光子的能量之和。也就是说，在双光子吸收中，单个光子的能量可能不足以将分子激发到更高的能量状态。然而，同时吸收两个光子，其综合能量与两个状态之间的能量差相匹配，允许发生激发。

为了促进这一过程，两个光子需要在1飞秒（10-15秒）的极短时限内与分子发生作用。为了实现这一目标，需要一个能产生快速光脉冲的聚焦激光器，其频率通常在80兆赫左右，提供从几百毫瓦到几瓦的峰值功率水平。

光的能量水平与它的波长直接相关。波长越短，能量越大。这种关系遵循一个线性模式，意味着波长为400纳米的光子的能量是波长为800纳米的光子的两倍。

传统的荧光显微镜使用单一的光子来刺激荧光染料，主要使用可见的激发波长从390纳米到700纳米。一旦被激发，电子就会经历一个过渡，回到其稳定状态，发出一个与激发光子相比能量略低的光子。这种能量损失是由于各种过程而发生的，如振动松弛、系统内交叉等。

在双光子显微镜中，两个光子，每个光子的能量是传统荧光显微镜中使用的单光子的一半（或两倍波长），同时被一个荧光染料吸收。这允许染料被激发到一个更高的能量状态。当被激发的电子返回到一个更稳定的轨道时，它发射出一个单光子，其波长与相应的单光子荧光法相同。这个发射的光子的波长比激发波长的一半要长，因为它对应于荧光体的激发态和基态之间的能量差。较长的波长是由于在激发态向基态的松弛过程中发生的能量损失。

广泛使用的荧光染料的典型激发光谱落在400至500纳米范围内。因此，当对这些染料采用双光子激发时，所使用的相应波长通常位于红外光谱中，特别是在800纳米和1000纳米（大约）之间。

双光子激发

双光子显微镜使用红色和近红外波长的短脉冲激光，通常在皮秒和飞秒范围内，作为激发源，在可见光谱内产生荧光。吸收波长约为350纳米的紫外线的荧光体，也可以被两个波长约为700纳米的近红外光子所激发。为使这种激发发生，两个光子必须同时到达荧光体。这里，"同时 "是指大约10×10-18秒的间隔。这种能力允许同时进行多色成像，有效地扩大了可观察的动态过程的范围。这种同时的双光子吸收的概率与瞬时光强的平方成正比，因此必须使用高强度的激光脉冲。

为了尽量减少对细胞或生物标本的潜在热损伤，采用超短激光脉冲是很有利的，比如那些由锁模激光器产生的脉冲持续时间在皮秒或飞秒范围内。双光子显微镜的一个流行选择是Ti:Sapphire激光器，它在800纳米左右发出非常短的脉冲（大约100 fs）的光，以大约80 MHz的重复率运行，并提供50 kW的明显高的峰值功率。

双光子显微镜的工作原理

一个锁模的Ti:Sapphire激光器被用来发射超短的近红外光脉冲，这是实现双光子激发的关键。这些脉冲然后通过一个扫描镜被引导到样品上，该扫描镜以可控的模式扫描激光束。放在扫描镜后的一个透镜将激光束聚焦到样品上，确保一个紧密的光斑以达到最大强度。之后，一个分色镜将激光反射到物镜上，同时允许发射的荧光通过，将激发光和荧光分开。具有高数值孔径的物镜从样品中收集发射的荧光，提供高分辨率的成像。

一个过滤器阻挡任何剩余的激发光或散射光，只允许发射的荧光到达检测器。另一个镜头收集并聚焦发射的荧光到一个称为光电倍增管（PMT）的高灵敏度检测器上，该检测器将光子转换为电信号，以便进一步放大和形成图像。

双光子显微镜的优点

在双光子激光扫描显微镜（TPLSM）中，采用了紧密聚焦的激发光束，导致焦点区域外的激发概率大大降低。这消除了 "焦外 "荧光的大量出现，这在没有使用共焦孔的单光子激发中经常观察到。因此，TPLSM本质上拥有光学切片能力，而不需要共焦孔径。另外，双光子激发在最大限度地减少光漂移方面提供了一个明显的优势。这是因为只有焦点处的特定区域可以被激发，减少了整体的光损伤。这一独特的特性来自于双光子激发对强度的二次方依赖，确保了在强度最大的焦点处有一个高度本地化的激发。

与紫外-可见光范围内的激发相比，使用近红外（near-IR）光的长波长激发具有更深的组织渗透的优势，因为长波长的散射和吸收减少。另外，没有紫外光会增强细胞和组织的活力，从而可以进行更多的扫描，有利于获得更好的三维图像。

除了固有的光学切片能力、减少光损伤和提高组织穿透力外，分辨率是评估双光子激光扫描显微镜潜力的另一个重要因素。双光子显微镜的分辨率由几个因素决定，包括物镜的数值孔径（NA），激发光的波长，以及成像系统的质量。此外，它还受到诸如样品的散射和吸收特性等因素的影响。在厚重或浑浊的样品中，散射会降低分辨率并限制穿透深度。

一般来说，双光子显微镜的分辨率优于传统的宽视场荧光显微镜，与共焦显微镜相当。诸如自适应光学和图像处理算法等技术可以分别通过补偿像差和纠正散射效应进一步提高双光子显微镜的分辨率。

双光子和多光子显微镜的应用

双光子和多光子显微镜在各个研究领域都有广泛的应用。在神经科学中，这些技术被用来研究活体脑组织中的神经元活动、突触连接和结构动态，使人们能够深入了解大脑功能和疾病。它们还在细胞生物学中得到应用，允许以高空间分辨率对亚细胞结构、细胞器和细胞内过程进行可视化。

在发育生物学中，双光子和多光子显微镜能够对生物体的胚胎发育和组织形态发生进行长期成像。这些技术也被用于免疫学，研究复杂组织内的免疫细胞相互作用和免疫反应。此外，双光子和多光子显微镜已被证明在调查肿瘤生物学、血管成像、药物输送和纳米材料相互作用方面具有价值，有助于推动生物医学研究和临床诊断的发展。