单光子激发和双光子激发是将原子或分子激发到高能态的两种不同机制。单光子激发是荧光激发的传统方法。它涉及使用单光子，单光子携带激发荧光团所需的能量。双光子激发是一种更先进的技术，与单光子激发相比，它可以进行更深层的组织成像，并减少光损伤。双光子激发利用了非线性激发过程，即两个波长较长的光子结合其能量激发荧光团。这种技术的原理是同时吸收两个能量较低的光子，使其能量相加达到激发所需的能量。

从上图可以看出，在单光子激发过程中，样品被一束光照射，这束光通常来自激光或灯，波长（λ=400 nm）与荧光团的吸收光谱相匹配。当荧光团吸收单个光子时，就会获得能量并发生电子转变，进入激发态。随后，当荧光团返回基态时，会发射一个能量较低的光子（λ=500 纳米），产生可检测和可视化的荧光。在双光子激发中，两个光子的能量（λ=800 纳米）被用来将荧光团激发到更高的能级。每个光子的能量通常是所需激发能量的一半。当两个具有适当波长和能量的光子在空间和时间上重合时，它们可以同时被荧光团吸收。这种同时吸收会导致荧光团过渡到激发态，从而实现荧光发射（λ=500 纳米）。

单光子激发

在单光子激发中，具有足够能量的光子被原子或分子吸收，导致电子从低能级跃迁到高能级。被吸收光子的能量应等于或大于系统初始状态和最终状态之间的能量差。单个光子的吸收会导致单个电子的激发。这一过程常用于各种应用中，例如荧光光谱，分子吸收光子后会发射能量较低的光子。它也是激光、发光二极管和太阳能电池等许多日常电子设备的工作原理。

在共振单光子激发的情况下，被吸收光子的能量与初始状态和最终状态之间的能量差精确匹配，从而实现系统的高效和选择性激发。

单光子激发的优势：

效率高： 所需的单光子能量正好或更大，可实现直接吸收过程。这意味着激发可以高效进行，无需任何额外步骤或中间状态。
简单： 单光子激发在概念上更简单，实验装置所需的组件也更少。它消除了与多光子过程相关的精确定时控制或复杂脉冲整形的需要。
单光子激发的缺点：

光子可用性： 产生具有特定能量的单光子是一项挑战，尤其是当所需能量无法从普通光源中轻易获得时?？赡苄枰诺墓庠椿蚣际?，如激光或高分辨率单色仪，这可能成本高昂，技术要求高。
背景噪音： 使用单光子源时，系统中的其他能级或外部光源可能会产生额外的背景噪声。这会降低信噪比，增加检测所需激发的难度。

双光子激发 

当两个能量较低的光子同时被原子或分子吸收并导致激发时，就会发生双光子激发。与单光子激发不同的是，两个光子的总能量必须等于或大于初始态和最终态之间的能量差。这种现象依赖于一种叫做双光子吸收的非线性光学效应。当同时吸收两个光子的概率明显高于连续吸收两个单个光子的概率时，就会出现这种现象。当样品暴露在高光子通量的强激光下时，更有可能发生双光子激发。

在共振双光子激发中，两个光子的总能量必须等于能量差。这种灵活性可使系统得到高效激发。

双光子激发的优点：

光子可用性： 当单光子源无法直接获取所需的能级时，双光子激发就会发挥优势。低能光子通常比高能光子更常见，因此更容易获得所需的光子。
背景抑制： 与单光子激发相比，双光子激发能更好地抑制背景。由于两个光子必须同时以特定的方式相互作用，因此可以大大降低来自其他能级或不符合双光子条件的光源的背景噪声。
增强穿透深度和减少光漂白：双光子激发对于在细胞等有限体积内进行点测量（如 FCS）具有优势。在这种技术中，只有共焦体积易受光漂白影响，从而最大限度地减少了不良影响。
宽广的吸收光谱：双光子激发具有宽广的吸收光谱，这在一些应用中可作为优势加以利用，如通过自发荧光进行组织轮廓分析，可对生物样本进行详细检查；由于激发体积由同一激发光束精确决定，因此可进行交叉相关测量，确保结果准确可靠。
双光子激发的缺点：

效率： 与单光子过程相比，双光子过程的激发概率通常较低。两个光子同时与系统相互作用的概率会随着强度的增加而降低，从而使激发效率降低。
复杂性：实施双光子激发需要仔细控制两个光子的相对时间和空间重叠。光源的精确同步和对准在技术上具有挑战性，实验装置可能会变得更加复杂。
激光安全： 双光子激发中使用的激光器通常属于第四类激光器，这意味着它们在直接观察和漫反射时都会对眼睛和皮肤造成潜在危害。
低吸收： 与单光子激发相比，双光子激发的吸收率要低得多。然而，这通常会导致更高的强度，从而带来细胞破坏的风险，可能导致细胞过热或 "沸腾"。
这两种策略的选择取决于具体的实验限制，包括是否有合适的光源、技术可行性以及所需的激发效率水平。