研究目的
实时研究单个G蛋白偶联受体(GPCR)分子中与激活相关的构象转变，以理解非活性与活性受体构象的平衡分布及构象交换的速率常数。
研究成果
单分子检测技术提供了关于受体激活与配体结合关联机制的详细信息，有助于设计更优化的靶向GPCR药物。该检测揭示了非活性态与类活性态构象之间的自发转变过程，以及配体如何影响这些转变。
研究不足
该研究聚焦于β2肾上腺素能受体，尽管这些方法可推广至其他G蛋白偶联受体（GPCRs），但针对不同受体可能需要优化特定条件和标记策略。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用一种新型单分子检测技术，通过单分子全内反射荧光显微镜实时监测单个GPCR分子中与激活相关的构象转变。
2：样本选择与数据来源：
β2肾上腺素受体（β2AR）通过位点特异性标记Cy3荧光探针，并重构成磷脂纳米盘。
3：实验设备与材料清单：
包括可进行全内反射荧光（TIRF）测量的显微镜、532纳米激发激光器以及增强型电荷耦合器件（CCD）相机。
4：实验流程与操作步骤：
对受体进行标记，重构成纳米盘后固定于载玻片上进行观察。
5：数据分析方法：
采集并分析每个识别光斑的发射强度，以确定受体非活性与活性构象状态的平衡分布。
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Ni-NTA resin
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Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific?
Purification of the receptor protein with poly-histidine tag.
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Axiovert 200 microscope
Axiovert 200
Carl Zeiss
Total internal reflection fluorescence (TIRF) measurements.
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Water-immersion C-Apochromat 63x/1.2 W objective
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr
Carl Zeiss
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Charge-coupled device (EMCCD) camera
DU-897E iXon+ EMCCD
Andor Technology
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PD-10 desalting column
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GE Healthcare
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http://finkenbeiner.com/quartzslides.php
Used for immobilizing receptor-nanodisc complexes for TIRF microscopy.
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Microscope cover slips
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Fisher Scientific
Used in the preparation of the sample chamber for TIRF microscopy.
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Scotch, 3M
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Concentration of protein samples.
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Cy3 maleimide, mono-reactive dye
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GE Healthcare
Fluorescent labeling of the receptor.
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Talon metal affinity resin
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Takara Bio
Purification of the receptor protein with poly-histidine tag.
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Superdex 200 Increase 100/300 size exclusion column
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GE Healthcare
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