研究目的
开发一种稳健的方法（SPEES-FRET），用于在具有强自发荧光的活细胞中进行定量FRET测量，从而准确测定FRET效率（E）和受体与供体分子之间的浓度比（RC）。
研究成果
SPEES-FRET方法对细胞自发荧光表现出强鲁棒性，即使在微弱发光细胞或低FRET效率细胞中，也能稳定准确地测量活细胞内的FRET效率和浓度比。这使其成为研究具有强自发荧光细胞中蛋白质相互作用的宝贵工具。
研究不足
该方法的准确性可能受到荧光蛋白成熟度和光漂白的影响。此外，该方法需要使用参考样本进行校准，且未经调整可能无法直接适用于所有细胞类型。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用激发-发射光谱解混技术（ExEm解混）将FRET信号分解为供体、受体、供体-受体敏化及自发荧光成分。
2：样本选择与数据来源：
使用HEK293和HepG2细胞，其中HEK293细胞具有强自发荧光，HepG2细胞显示低自发荧光。
3：实验设备与材料清单：
采用配备特定滤光片和CCD相机的自组装光谱宽场显微镜（SM）进行测量。
4：实验流程与操作步骤：
该方法包括测量低自发荧光细胞中供体与受体的光谱特征、强自发荧光细胞的自发光谱特征，并对FRET样本应用光谱解混。
5：数据分析方法：
将激发-发射光谱线性解混为四个成分，并利用预设校正因子计算E值和RC值。
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wide-field fluorescence microscope
IX73
Olympus
Used for fluorescence imaging of living cells.
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metal halide lamp
HGLGPS
Olympus
Provides excitation light for fluorescence imaging.
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CCD
ORCA-Flash 4.0
Hamamatsu
Captures fluorescence images.
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fiber optic spectrometer
QE65 Pro
Ocean Optics
Measures emission spectra.
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excitation filters
Ex435 cube, Ex470 cube
Olympus, Chroma
Filters excitation light to specific wavelengths.
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