研究目的
开发一个双荧光素酶报告系统，用于监测神经元特异性miRNA-9和miRNA-124a在体外和体内神经元分化过程中的表达模式。
研究成果
双荧光素酶报告系统成功监测了miRNA-9和miRNA-124a在体内外神经元分化过程中的动态表达。该系统为实时成像多种生物过程中miRNA提供了无创工具。
研究不足
该研究聚焦于P19细胞和裸鼠神经元分化过程中的miRNA-9与miRNA-124a，未探究其对其他miRNA或细胞类型的适用性。双荧光素酶报告系统需进行转染操作，可能不适用于所有细胞类型。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用双荧光素酶报告系统监测神经元分化过程中的miRNA表达。该系统包含受PGK启动子调控（其3'UTR含有miRNA靶序列）的萤火虫荧光素酶（Fluc）基因，以及受SV40启动子调控用于标准化的海肾荧光素酶（Rluc）基因。
2：样本选择与数据来源：
使用P19细胞（小鼠胚胎畸胎瘤细胞系）和HEK293细胞（人胚胎肾细胞）。P19细胞通过维甲酸（RA）诱导神经元分化。
3：实验仪器与材料清单：
仪器包括用于荧光素酶检测的Glomax-20/20发光计和用于生物发光成像的Xenogen Lumina Π系统。材料包括DMEM生长培养基、胎牛血清、转染试剂Lipofectamine 2000，以及荧光素酶底物D-荧光素和腔肠素。
4：实验流程与操作步骤：
将细胞与报告质粒和miRNA模拟物共转染，用RA处理诱导分化后，进行荧光素酶检测和生物发光成像。
5：数据分析方法：
测量荧光素酶活性并相对于Rluc活性进行标准化。使用Living Imaging Software 4.1对生物发光信号进行定量分析。
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Glomax-20/20 Luminometer
Promega
Measurement of luciferase activities
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Xenogen Lumina Π system
Caliper Life Sciences
Bioluminescence imaging
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Lipofectamine 2000
Invitrogen
Transfection reagent
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D-luciferin
Shanghai YEASEN
Substrate for firefly luciferase
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Coelenterazine
Shanghai YEASEN
Substrate for Renilla luciferase
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