研究目的
利用二次谐波成像技术描述人角膜胶原纤维束的水平排列方式。
研究成果
通过使用二次谐波成像技术，研究人员阐明了人角膜不同深度和焦点区域的角膜胶原纤维束水平排列情况。这些胶原纤维束在水平面上呈现出复杂的分叉与合并模式。将这些分叉与合并模式量化为胶原排列不规则度后发现，其数值从后部基质层到浅层基质层、从角膜中央区到角膜缘区逐渐增大。
研究不足
我们简化的模式分析方法未能完全呈现角膜胶原纤维束的真实分布特征。在软件图像分析过程中，可能遗漏了细微的模式差异。逐根统计图像中每条胶原纤维束是更精确的方法，但受限于图像分辨率而无法实施。本研究的另一局限在于基质层褶皱的存在，尤其是角膜中央及后部区域。这些褶皱很可能源于组织保存过程中的轻度水肿及成像时的重力影响。我们无法排除部分组织褶皱可能对本研究采用的图案分析造成干扰的可能性。
1：实验设计与方法选择：
使用倒置双光子激发荧光显微镜对人角膜进行成像。将激发激光器（钛宝石激光器）调谐至850纳米波长。通过425/30纳米带通发射滤光片收集二次谐波产生的背向散射信号?；袢《喔隽抑氐耐枷穸颜唬▃轴堆栈）以生成三维数据集。采用ImageJ软件分析每个图像平面上胶原纤维束的排列模式（不规则性）。
2：样本选择与数据来源：
从美国佛罗里达中部狮子眼及组织库（坦帕市，佛罗里达州）获取七例不适合人类移植的眼库角膜。
3：实验设备与材料清单：
倒置双光子激发荧光显微镜（FluoView FV-1000；Olympus，美国宾夕法尼亚州中央谷地）、钛宝石激光器、425/30纳米带通发射滤光片、玻璃底培养皿（35毫米；MatTek，美国马萨诸塞州阿什兰）、平衡盐溶液（BSS；Alcon，美国德克萨斯州沃斯堡）。
4：实验步骤与操作流程：
将角膜置于玻璃底培养皿上，将激光调谐至850纳米并通过二向色镜引导，使用水浸物镜聚焦激发光束并收集背向散射信号；二次谐波信号经二向色镜反射后通过带通发射滤光片收集，以约15秒采集一幅1024×1024像素分辨率的方形图像，并使用同一物镜获取多个连续且重叠的图像堆栈（z轴堆栈）。
5：数据分析方法：
采用ImageJ软件分析获取的图像。对灰度二次谐波图像依次进行包括空间频率滤波和二值化转换在内的图像处理。
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FluoView FV-1000
FV-1000
Olympus
Inverted TPEF microscope used for SHG imaging
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Ti:Sapphire laser
Excitation laser tuned to 850 nm for SHG imaging
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425/30-nm bandpass emission filter
Filter used to collect backscatter signals of SHG
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glass-bottom dish
35 mm
MatTek
Used to place the cornea sample during imaging
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balanced salt solution
BSS
Alcon
Applied to the samples to prevent desiccation
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