研究目的
为了比较操作者自主选择图像与透射电子显微镜中预设位置拍摄的图像在可视化细胞外囊泡方面的效果，采用四种制备方案、单一样本和同一台仪器，以提高可比性和可重复性。
研究成果
操作员自主选图虽能生成高质量图像，但会弱化实验方案差异，故不适用于评估样本质量。预设位置的图像更能反映整体样本质量。方案A效果最佳，建议统一透射电镜实验方案与选图标准以提高外泌体研究的可重复性。
研究不足
该研究仅使用了一个电动汽车样本和一台透射电镜仪器，限制了结果的普适性。由于设备可用性和时间限制，未对冷冻电镜技术进行评估。图像筛选过程中可能存在的操作者偏差会影响结果，且实验方案中存在许多未充分优化的变量。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用四种EV制备方案（A-D），比较操作者自主选区与透射电镜（TEM）网格预设位点成像效果，评估图像质量、EV数量及背景情况。为控制变量，仅使用单一尿液EV样本和同一台TEM设备。
2：样本选择与数据来源：
通过离心和超速离心法制备健康男性混合尿液EV样本，另采用无血小板血浆样本进行补充验证。
3：实验设备与材料清单：
TEM载网（镀碳Formvar膜的铜网/镍网）、离心机（Hettich Rotina 46RS）、超速离心机（Beckman Coulter Optima MAX-XP配TLA-55转子）、滤膜（Merck 0.22μm；GE Healthcare 0.05μm Nucleopore）、试剂（戊二醛、醋酸铀等）、TEM设备（FEI Tecnai-12）、CCD相机（Olympus Veleta）、软件（Olympus Imaging Solutions；Adobe Photoshop v11.0.2）。
4：22μm；GE Healthcare 05μm Nucleopore）、试剂（戊二醛、醋酸铀等）、TEM设备（FEI Tecnai-12）、CCD相机（Olympus Veleta）、软件（Olympus Imaging Solutions；Adobe Photoshop v2）。 实验流程与操作规范：
4. 实验流程与操作规范：应用方案A-D制备含EV的TEM载网。每组方案拍摄三张载网：每网包含1个操作者选定区域和5个预设位点，成像倍率49,000×。采用Photoshop半自动分割法进行EV计数。
5：数据分析方法：
评估EV数量、杯状EV占比、图像质量及背景质量。使用Prism 7.0软件进行ANOVA方差分析与t检验。
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获取完整内容-
Transmission Electron Microscope
Tecnai-12
Fei
Used for imaging extracellular vesicles with nanometre resolution.
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CCD Camera
Veleta
Olympus
Side-mounted camera for capturing TEM images with 2,048 x 2,048 resolution.
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Software
Imaging Solutions
Olympus
Software for image acquisition and analysis in TEM.
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Centrifuge
Rotina 46RS
Hettich
Used for centrifuging urine samples to remove cells and precipitated salts.
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Ultracentrifuge
Optima MAX-XP
Beckman Coulter
Used for concentrating extracellular vesicles from samples.
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Filter
Nucleopore
GE Healthcare
Used for filtering phosphate-buffered saline to remove particles.
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Software
Photoshop v11.0.2
Adobe Systems
Used for semi-automated segmentation of EVs in TEM images.
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Statistical Software
Prism 7.0
GraphPad
Used for statistical analysis of data, including ANOVA and t-tests.
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UV Light
TUV30W G30T8
Philips
Used for treating TEM grids to enhance EV adhesion in protocol C.
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