研究目的
通过研究血卟啉单甲醚（Ce6）与纯化牛视紫红质的结合，来理解进化上保守的信号通路在视紫红质结构中被变构激活的功能后果。
研究成果
Ce6与牛视紫红质的结合较弱，对Meta II态和视蛋白态的亲和力高于暗态。它作为变构调节剂，扰动胞质结构域并抑制G蛋白激活，但不会改变吸收最大值或增加暗噪声。这些结果支持Ce6在调节视紫红质结构和功能中的作用，可能推广至其他GPCR，但其对视觉的生理相关性可能有限。
研究不足
Ce6的结合亲和力较弱（微摩尔级别），核磁共振实验中使用的高浓度可能导致Ce6聚集，从而影响结果。该研究以牛视紫红质为模型，虽然通过序列保守性支持向深海鱼视紫红质的推论，但可能无法完全反映体内条件。红光敏化机制尚未完全阐明，能量转移假说也未得到实验验证。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用生物物理和生化方法（包括吸收光谱、荧光光谱及核磁共振波谱技术1H、19F、1H-15N HSQC）探究血卟啉单甲醚（Ce6）与牛视紫红质的结合机制，并通过理论模型计算结合亲和力及分析构象变化。
2：1H、19F、1H-15N HSQC）探究血卟啉单甲醚（Ce6）与牛视紫红质的结合机制，并通过理论模型计算结合亲和力及分析构象变化。 样本选择与数据来源：
2. 样本选择与数据来源：牛视紫红质样本取自牛视网膜纯化或HEK293细胞表达体系，Ce6为市售商品。研究涵盖视紫红质的暗态、Meta II态及视蛋白构象。
3：实验设备与材料清单：
设备包含分光光度计（用于吸收/荧光检测）、核磁共振仪（布鲁克600MHz/800MHz/900MHz机型）、光照系统（Fiber-Lite DC 950光源、Schott KL1500光源）及滤光片；材料包括磷酸钠缓冲液、十二烷基麦芽糖苷（DM）、二甲基亚砜（DMSO）及11-顺式视黄醛、9-顺式-14-氟视黄醛等特异性试剂。
4：实验流程与操作规范：
操作步骤含样本制备（如19F/15N标记视紫红质）、Ce6滴定、光照激活及特定时间点数据采集，核磁共振实验均在避光条件下进行以防止非特异性激活。
5：数据分析方法：
运用SigmaPlot软件处理结合曲线数据，TopSpin软件分析核磁数据，并采用统计学检验（如学生t检验）。具体方法包括吸收光谱差减法、荧光校正及化学位移分析。
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NMR Spectrometer
600 MHz
Bruker
Used for acquiring 1D and 2D NMR spectra to study protein-ligand interactions and conformational changes.
-
NMR Spectrometer
800 MHz
Bruker
Used for selective excitation 1H NMR experiments.
-
NMR Spectrometer
900 MHz
Bruker
Used for 1H-15N HSQC NMR spectroscopy.
-
Retinal
9-cis-retinal
Sigma-Aldrich
Used in reconstitution experiments.
-
CryoProbe
5 mm QCI CryoProbe
Bruker
Used for sensitive NMR detection.
-
Software
TopSpin Version 2.0
Bruker
Used for NMR data acquisition and analysis.
-
Light Source
Fiber-Lite DC 950
Dolan-Jenner industries
Used for illuminating samples in experiments.
-
Light Source
Schott KL1500
Schott
Used for illumination with specific filters.
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Filter
630 nm long-pass filter
HV Skan
Used for selective red light illumination in absorbance spectroscopy.
-
Filter
495 nm filter
Schott
Used for full bleaching of rhodopsin.
-
Sepharose-4B
Sigma
Used for affinity purification of rhodopsin.
-
Antibody
1D4
University of British Columbia
Used for immunoaffinity purification of rhodopsin.
-
Chlorin e6
Frontier Scientific
The ligand studied for binding to rhodopsin.
-
Fluororetinal
9-cis-14-fluororetinal
Synthesized and used for 19F NMR studies.
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Detergent
Dodecyl maltoside
Used for solubilizing rhodopsin in micelles.
-
NMR Tube
Shigemi NMR tube
Shigemi
Used for NMR sample containment.
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Software
Sigmaplot 10.0
Sigmaplot
Used for scientific graphing and binding affinity calculations.
-
Vacuum Manifold
Millipore
Used for filter binding assays.
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Scintillation Counter
LSC 6500
Beckman
Used for measuring radioactivity in GTPγS assays.
-
Scintillation Cocktail
ScintiSafe LSC-cocktail
Fischer Scientific
Used in radioactivity measurements.
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