研究目的
通过使用纳米抗体替代抗体来最小化DNA-PAINT超分辨率显微镜中的连接误差，从而实现具有更低位移误差的高分辨率多目标成像。
研究成果
基于纳米抗体的DNA-PAINT技术将连接误差显著降低至约4纳米，可在每个靶标35分钟内实现细胞结构的高分辨率（20纳米）多重成像。该方法利用了纳米抗体的小尺寸和高特异性，使其成为生物研究中超分辨显微镜技术的多功能工具。
研究不足
该方法依赖于针对特定荧光蛋白的纳米抗体，可能无法覆盖所有内源性蛋白。目前实现的分辨率（20纳米）仍高于DNA-PAINT的理论极限，需要进一步优化。微流控装置和定制设备可能并非所有实验室都能轻易获取。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用DNA-PAINT技术，通过连接至DNA对接链的纳米抗体实现超分辨率成像。使用定制的TIRF显微镜和微流控装置对多个靶标进行顺序成像。
2：样本选择与数据来源：
将编码荧光蛋白（EGFP、mCherry、mTagBFP）与细胞器特异性蛋白（线粒体、高尔基体、染色质）融合的质粒转染至COS-7细胞。
3：实验设备与材料清单：
定制TIRF显微镜、配备电磁阀和蠕动泵的微流控系统、纳米抗体（FluoTag?-Q抗GFP/抗RFP/抗TagBFP）、DNA寡核苷酸、化学试剂（TCEP、马来酰亚胺-DBCO交联剂）、细胞培养材料。
4：实验流程与操作步骤：
细胞经固定、透化后，用纳米抗体-DNA偶联物染色，并通过交换PAINT技术依次引入成像链进行顺序成像。每个靶标采集35分钟含漂移校正的影像数据。
5：数据分析方法：
使用Picasso软件进行定位与图像重建，通过傅里叶环相关（FRC）和SQUIRREL算法评估分辨率。
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FluoTag-Q anti-GFP
N0301
NanoTag Biotechnologies GmbH
Binding to GFP family fluorescent proteins for labeling in DNA-PAINT
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FluoTag-Q anti-RFP
N0401
NanoTag Biotechnologies GmbH
Binding to RFP family fluorescent proteins for labeling in DNA-PAINT
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FluoTag-Q anti-TagBFP
N0501
NanoTag Biotechnologies GmbH
Binding to mTagBFP and related fluorescent proteins for labeling in DNA-PAINT
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Staining DNA in gels for quality control
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UFC501096
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Buffer exchange and concentration of nanobodies
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Superdex 75 Increase Column
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Size exclusion chromatography for purifying conjugated nanobodies
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25
GE Healthcare
Chromatography system for protein purification
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Software for controlling microfluidic setup
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Analysis of DNA-PAINT movies for super-resolution imaging
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Image processing and merging of super-resolved images
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