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单分子荧光光谱和硫黄素T荧光检测法揭示α-突触核蛋白突变体对脂质结合与聚集的不同影响
摘要： 目前已知有六个α-突触核蛋白点突变与家族性帕金森综合征相关：A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T。我们通过全面的体外分析研究了所有α-突触核蛋白突变对脂质结合及聚集行为的影响。结果显示：A30P的脂质结合能力显著降低，G51D中度减弱，其他突变体仅有极轻微下降。A30P特别容易形成金属离子诱导的寡聚体，而A53T仅表现出微弱的寡聚倾向。相反，H50Q、G51D和A53T快速形成纤维，A30P则形成缓慢，表明易形成寡聚体的突变体形成纤维的倾向较低。铁离子存在时野生型α-突触核蛋白、A30P和A53T的纤维形成均受抑制的现象支持该结论。此外，我们发现A30P或A53T与野生型α-突触核蛋白混合物的聚集动力学由聚集更快的变体决定。这些结果表明分子层面存在差异机制参与α-突触核蛋白病理过程，这可能有助于深入理解帕金森病发病机制，并为制定预防策略和疾病修饰治疗提供潜在关联。
关键词： 突触核蛋白病，α-突触核蛋白（α-Synuclein），帕金森病，蛋白质-脂质相互作用，蛋白质聚集，突变体
更新于2025-09-23 15:23:52
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利用AgHalo传感器通过荧光分析法量化活细胞中的蛋白质稳态
摘要： 适当的细胞蛋白质稳态对细胞健康和存活至关重要。外源应激条件会破坏蛋白质稳态并导致细胞蛋白聚集。我们开发了一种荧光传感器（AgHalo）来量化应激诱导的蛋白质稳态缺陷。该AgHalo传感器采用不稳定的HaloTag变体来模拟易聚集的细胞蛋白，并配备了一系列荧光探针——当传感器形成可溶性寡聚体或不溶性聚集体时，这些探针会呈现荧光增强现象。本文提供了使用方案，阐述如何通过直接荧光读数及荧光酶标仪/显微镜观察，利用AgHalo传感器在活细胞中可视化和量化蛋白质组应激。此外还描述了将AgHalo传感器与荧光探针及市售HaloTag探针联用实现双色成像实验的方案。这些方案能借助AgHalo传感器实现活细胞蛋白质稳态的可视化和量化——这是以往持续荧光方法难以完成的任务。
关键词： 蛋白质聚集、荧光强度、蛋白质稳态、荧光传感器
更新于2025-09-23 15:21:21
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活细胞超分辨率显微镜显示扩散在多聚谷氨酰胺驱动的聚集体组装中起主要作用
摘要： 在严格控制的试管条件下，错误折叠蛋白质自组装形成淀粉样聚集体的机制已被广泛研究。然而这些过程在多大程度上能代表细胞环境中的实际情况仍不明确。通过活细胞的超分辨率成像技术，我们发现一种含聚谷氨酰胺的淀粉样变性蛋白首先在胞质中主要通过扩散作用形成小型无定形聚集体簇。这些聚集体簇间的动态相互作用限制了其延伸生长，最终形成具有分支形态的结构——这与体外实验中观察到的以线性纤维为主的结构存在差异。部分聚集体簇随后通过微管组织中心的主动运输进行组装，从而启动核周聚集体（aggresome）的形成。尽管学界普遍认为聚集体形成完全由微管上的主动运输调控，但我们采用先进成像与数学建模相结合的方法证明：扩散才是驱动聚集体扩张的主要机制。研究发现，随着扩张的聚集体表面积增大，胞质聚集体的扩散沉积速率随之提升，该途径很快成为聚集体组装的主导方式。我们的发现对既往提出的聚集体形成理论提出了新见解。同时证实聚集体随时间推移逐渐成熟，结构增长过程中会变得更加致密。大型核周聚集体的存在会深刻影响细胞行为与健康状态，而我们的超分辨率成像结果表明：聚集体的形成与发展受高度动态过程调控，这一发现对潜在治疗策略的设计可能具有重要意义。
关键词： 分子建模、蛋白质聚集、分子成像、被动运输、淀粉样蛋白、聚集体形成、运输、活细胞结构光照显微镜技术、蛋白质错误折叠、分子动力学
更新于2025-09-23 15:21:21
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细胞内聚谷氨酰胺蛋白聚集体光漂白过程中荧光损失的间断伽辽金模型
摘要： 背景：细胞内具有扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）链的蛋白质发生相分离与聚集，是多种年龄相关神经退行性疾病的标志性特征。要深入理解这些过程，关键在于对适当标记蛋白进行定量荧光成像。光漂白后荧光损失（FLIP）技术特别适用于研究亨廷顿舞蹈症等polyQ疾病细胞模型中蛋白质聚集的动态过程，因其能完整呈现细胞结构内强度变化的全时空分布特征。与其他方法相比，该技术还能在细胞区室荧光损失随时间演变过程中显现微弱聚集物。但目前针对FLIP数据的计算分析方法较少，且缺乏从实验FLIP序列估算转运与扩散参数的运输模型。 结果：本文提出一种用于分析细胞内多聚谷氨酰胺蛋白聚集物（又称包涵体IBs）FLIP成像实验的计算方法。通过该方法可测定polyQ蛋白的扩散常数、核膜转运系数以及聚集物与胞质间的交换速率。我们基于反应-扩散多区室模型构建计算体系，其网格由FLIP序列细胞图像分割获得，并采用间断伽辽金（DG）方法在FEniCS平台实现数值模拟，显著提升了计算效率。将该方法应用于代表性实验FLIP序列后，获得了所有转运参数的一致性估算值。 结论：通过新开发的计算FLIP方法直接从活细胞图像序列估算转运参数，意外揭示了突变亨廷顿蛋白在胞质与微弱包涵体间存在极快的交换动力学过程。这一发现可能同样适用于其他polyQ疾病。因此，本方法可用于量化神经退行性疾病细胞模型中蛋白质聚集过程各阶段的动态特征。
关键词： 翻转，计算方法，多室，速率系数，间断伽辽金，校准，蛋白质聚集
更新于2025-09-04 15:30:14