通过改进的FRET/FLIM分析方法测量活细胞中转录因子Nrf2与其负调控因子Keap1的相互作用

摘要： 转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）及其主要负调控蛋白Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）构成了一套分子效应与传感系统，通过协调全面的细胞?；こ绦?，对细胞氧化还原稳态的扰动作出强效响应。在稳态条件下，Nrf2是一种短寿命蛋白，会被靶向泛素化及蛋白酶体降解。当遇到亲电试剂、氧化剂或促炎刺激时，Keap1中的半胱氨酸传感器会发生化学修饰，导致其无法靶向降解Nrf2，进而使该转录因子积累并增强细胞?；せ虻淖肌Ｋ淙煌ü嘀痔逋庀低骋焉钊虢馕隽薔rf2与Keap1的蛋白互作关系，但能在活细胞环境中评估这些互作的检测方法却很少。我们先前开发了基于成像的FLIM/FRET技术来可视化和测量单细胞中Nrf2与Keap1的相互作用。本研究旨在改进该方法以提高通量与精度，并降低细胞间差异性。为消除方向偏倚可能性，我们在Keap1与FRET受体荧光蛋白标签间引入了柔性连接肽；为确保Nrf2-FRET供体荧光蛋白标签的正确成像，采用sfGFP作为FRET供体使其成熟时间与内源性Nrf2半衰期匹配。全局分箱法提升了检测通量，而分析过程中纳入实测仪器响应函数则提高了精度。应用该方法发现结果与受体表达水平存在强共变关系，通过考虑受体水平可规避细胞间差异性，从而增强活细胞中Keap1-Nrf2相互作用测量的灵敏度。