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通过改进的FRET/FLIM分析方法测量活细胞中转录因子Nrf2与其负调控因子Keap1的相互作用

DOI：10.1021/acs.chemrestox.8b00354 期刊：Chemical Research in Toxicology 出版年份：2019 更新时间：2025-11-21 11:08:12
摘要： 转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）及其主要负调控蛋白Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）构成了一套分子效应与传感系统，通过协调全面的细胞?；こ绦?，对细胞氧化还原稳态的扰动作出强效响应。在稳态条件下，Nrf2是一种短寿命蛋白，会被靶向泛素化及蛋白酶体降解。当遇到亲电试剂、氧化剂或促炎刺激时，Keap1中的半胱氨酸传感器会发生化学修饰，导致其无法靶向降解Nrf2，进而使该转录因子积累并增强细胞保护基因的转录。虽然通过多种体外系统已深入解析了Nrf2与Keap1的蛋白互作关系，但能在活细胞环境中评估这些互作的检测方法却很少。我们先前开发了基于成像的FLIM/FRET技术来可视化和测量单细胞中Nrf2与Keap1的相互作用。本研究旨在改进该方法以提高通量与精度，并降低细胞间差异性。为消除方向偏倚可能性，我们在Keap1与FRET受体荧光蛋白标签间引入了柔性连接肽；为确保Nrf2-FRET供体荧光蛋白标签的正确成像，采用sfGFP作为FRET供体使其成熟时间与内源性Nrf2半衰期匹配。全局分箱法提升了检测通量，而分析过程中纳入实测仪器响应函数则提高了精度。应用该方法发现结果与受体表达水平存在强共变关系，通过考虑受体水平可规避细胞间差异性，从而增强活细胞中Keap1-Nrf2相互作用测量的灵敏度。
作者： Dina Dikovskaya，Paul L. Appleton，Claudia Bento-Pereira，Albena T. Dinkova-Kostova
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研究概述 实验方案 设备清单

研究目的

改进现有的FLIM/FRET方法，用于监测单活细胞中Nrf2与Keap1的相互作用，以提高通量、精度并降低细胞间变异性。

研究成果

改进的FLIM/FRET方法成功提高了活细胞中Nrf2-Keap1相互作用测量的通量和精度。关键改进包括全局合并、使用实测仪器响应函数、采用柔性连接子以避免方向偏差，以及使用sfGFP以更好表征短寿命的Nrf2。受体水平被确认为变异性的主要来源，对其加以考量后提高了灵敏度和可重复性。该方法能稳健检测相互作用强度的细微变化。

研究不足

该方法可能因受体表达水平的细胞间差异而受到影响，且过表达系统可能无法完全反映内源性条件。活体成像过程中的光毒性和细胞运动对采集时间和激光功率构成限制。

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