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[分子生物学方法] 星形胶质细胞 第1938卷（方法与实验方案）|| 基于荧光激活细胞分选的成年斑马鱼端脑神经干细胞分离与鉴定
摘要： 成年哺乳动物（包括人类）大脑的新生神经元数量相当有限，再生能力也较差。相比之下，具有胶质细胞特性且能产生神经元的神经干细胞（NSC）在成年斑马鱼大脑中广泛存在。值得注意的是，神经干细胞在损伤刺激下的激活及新生神经元的产生，可促使斑马鱼大脑实现再生。因此，理解调控神经干细胞应对损伤行为的分子通路至关重要——这既能为后续实验性修饰哺乳动物大脑损伤后胶质细胞中的这些通路奠定基础，也有助于激发神经元再生。本文详述了我们成功用于从成年斑马鱼端脑前瞻性分离神经干细胞、提取RNA并制备cDNA文库以进行下一代测序（NGS）和全转录组分析的操作流程，这是探究斑马鱼修复性神经发生调控机制的第一步。此外，我们还介绍了一种通过胞内荧光激活细胞分选（FACS）分析成年斑马鱼大脑神经干细胞抗原特性的替代方法，利用该方法可检测前瞻性分离的干细胞群中增殖细胞核抗原（PCNA）阳性的增殖性神经干细胞数量。
关键词： 神经干细胞，神经干细胞纯化，细胞内流式细胞术，斑马鱼
更新于2025-09-23 15:23:52
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成年斑马鱼皮肤伤口愈合过程中血管生成的活体成像
摘要： 血管生成（从已有血管中生长出新血管）对皮肤伤口愈合至关重要。然而，内皮细胞（ECs）和周细胞（PCs）如何在皮肤血管生成过程中建立新血管仍不明确。我们建立了活体成像系统来分析成年斑马鱼的皮肤血管生成。首先，我们描述了皮肤血管的基本结构。在正常皮肤组织中，内皮细胞和周细胞保持静止状态以维持休眠的血管；而皮肤损伤会立即通过血管内皮生长因子信号通路诱导血管生成。损伤后数周内会形成迂曲且无序的血管网络，随后通过数月的血管退化逐渐恢复正常。对单条受损血管修复过程的分析显示：断裂的血管在损伤后会延长并相互吻合。此后，修复的血管与邻近未受损血管通过增加内皮细胞数量变得迂曲。与此同时，周细胞分裂并迁移以覆盖这些迂曲血管。内皮细胞从被周细胞覆盖的迂曲血管中萌发，这表明内皮细胞萌发不需要周细胞从血管壁脱离。因此，成年斑马鱼皮肤血管生成的活体成像使我们能够阐明内皮细胞和周细胞在皮肤血管生成过程中如何形成新血管。
关键词： 周细胞、皮肤伤口愈合、血管生成、内皮细胞、斑马鱼
更新于2025-09-23 15:23:52
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光激活氯离子通道的心脏电生理效应
摘要： 过去十年间，光遗传学已成为监测和调控可兴奋组织（包括心脏）中特定细胞类型行为的范式转变技术。阳离子通道视紫红质（ChR）的激活会导致膜去极化，从而有效触发电心肌细胞的动作电位（AP）。相比之下，开发通过超极化抑制AP产生的光遗传学工具仍具挑战性。来自小球藻（Guillardia theta）的绿光激活型ChR（GtACR1）介导的Cl?驱动光电流已被证实能沉默多种神经元中的AP产生，因此被认为可能适用于抑制心肌细胞活动。通过单细胞电生理记录、收缩追踪、细胞内微电极记录以及对完整心脏的在体光学记录，我们发现持续光照激活GtACR1会使心脏细胞停滞于去极化状态，从而抑制再兴奋。与此一致的是，短暂光脉冲激活GtACR1会在离体兔心肌细胞和自发搏动的斑马鱼完整心脏中诱发动作电位。结果表明，GtACR1对AP产生的抑制源于细胞去极化。虽然这并未解决通过生理手段（即超极化）实现光遗传学沉默的需求，但GtACR1作为通过瞬时光诱导去极化激活心肌细胞的潜在有效工具具有吸引力。
关键词： 心脏、动作电位、斑马鱼、光遗传学、GtACR1、天然阴离子通道视紫红质
更新于2025-09-23 15:22:29
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Arl13b与Vangl2相互作用调控斑马鱼纤毛和光感受器外节长度
摘要： ARL13B基因突变会导致经典型Joubert综合征（一种常染色体隐性纤毛疾病，伴有不同程度的视网膜退化）。由于第二位点修饰等位基因可能影响纤毛疾病的视网膜病理表现，动物模型为研究基因互作如何调控特定表型提供了独特平台。本研究通过分析斑马鱼arl13b突变体，探究其视网膜退化特征及与平面细胞极性蛋白（PCP）组分vangl2的上位关系：采用光镜和电镜观察光感受器与纤毛结构，运用免疫组化检测纤毛标志物，通过杂合子配对杂交测试遗传互作，利用囊胚移植生成遗传嵌合体并借助荧光显微镜分析。结果显示：受精后第5天，arl13b?/?突变体光感受器外节较野生型幼鱼缩短，但光镜或电镜均未观察到明显视网膜退化迹象；从受精后14天（dpf）持续至30dpf，移植到野生型宿主中的Arl13b缺失细胞发生死亡；arl13b?/?;vangl2?/?双突变体的光感受器损伤程度较单突变体更为严重；而vangl2?/?突变视锥光感受器在野生型视网膜环境中可维持正?；宥ㄎ?。研究表明：arl13b?/?突变体存在纤毛和光感受器外节缩短现象，并呈现数周内缓慢进展的光感受器退化过程。数据表明Arl13b缺失会导致光感受器渐进性退化，且该过程可被vangl2缺失加剧。重要的是，实验证实Arl13b能与Vangl2发生遗传学及物理性互作，这种关联对维持正常光感受器结构至关重要——但vangl2缺失并不影响基体定位。
关键词： Arl13b、平面极性、光感受器、纤毛、斑马鱼、视网膜、Vangl2
更新于2025-09-23 15:21:21
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用于活细胞和斑马鱼中次氯酸可视化检测的快速响应荧光探针
摘要： 基于C=N键对次氯酸根(ClO?)的特异性消除作用，本研究开发了一种新型快速响应、可见荧光探针(D1)用于监测次氯酸根。该探针对ClO?的响应呈线性增长，荧光强度提升约25倍。通过肉眼观察，D1在10秒内即可高选择性和高灵敏度地响应ClO?。该探针不仅能在体外(如尿液)检测次氯酸根水平，还能在低至-78°C的极寒条件下监测次氯酸根含量。同时，良好的生物相容性确保了D1可通过共聚焦显微镜检测细胞内ClO?。此外，D1已成功应用于斑马鱼中外源性和内源性ClO?的荧光成像监测。
关键词： 斑马鱼、活细胞成像、次氯酸盐、快速响应、荧光探针
更新于2025-09-23 15:21:01
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前沿科学：活体晶格光片显微镜揭示迁移白细胞的动态细胞及亚细胞特征
摘要： 中性粒细胞和巨噬细胞（M??）的迁移是炎症反应的基础。然而，吞噬细胞快速移动、多向瞬时运动以及可塑性极强的形态变化，使得高分辨率活体成像面临挑战。晶格光片显微镜（LLSM）能以卓越的时空分辨率捕捉高度动态的细胞形态。我们首次将LLSM广泛应用于活体白细胞研究，采用光学透明的斑马鱼模型、能显示亚细胞结构的白细胞特异性报告基因系，以及白细胞迁移创伤实验。LLSM揭示了迁移白细胞的形态细节，可在原生生理环境中对其高度动态活动进行精细的三维观测。现在必须将反复出现的极薄尾足延伸视为迁移中性粒细胞的特征性表现。LLSM解析了拖尾的尾足延伸结构，显示出其惊人长度，并能定量评估细胞骨架对其瞬态形态的贡献。在LLSM的时空分辨率下观测血管微环境中的白细胞，展现了血流诱导的中性粒细胞动力学，并揭示了白细胞诱导内皮变形等意外白细胞-内皮相互作用（这种变形可抵抗血管内压力）。针对吞噬作用和细胞死亡的LLSM成像提供了亚细胞层面的发现，并揭示了新行为模式。综合而言，我们通过LLSM呈现了白细胞结构（丝状伪足、片状伪足、尾足延伸、囊泡）与活动（间质/血管内迁移、白细胞滚动、吞噬作用、细胞死亡及胞质膨胀）的高分辨率实例。将LLSM应用于活体白细胞成像，为深入研究吞噬细胞生物学的细胞与亚细胞复杂性奠定了变革性基础。
关键词： 尾足，白细胞，迁移，斑马鱼，晶格光片显微镜，吞噬细胞
更新于2025-09-23 15:19:57
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辐照剂量对巨噬细胞动力学、氧化应激及创面愈合的实时活体成像影响
摘要： 目的：本研究旨在通过实时活体成像技术，量化氦氖激光不同照射剂量对巨噬细胞动力学、组织氧化应激及创面愈合的影响。背景：已有研究表明光生物调节可减轻组织炎症并加速创面愈合，但优化巨噬细胞行为的激光参数尚未明确。我们假设定量实时活体成像能确定促进巨噬细胞迁移、降低活性氧及加速创面愈合的最佳能量密度。方法：采用Tg(mpeg-dendra2)转基因斑马鱼幼体，负载二氢乙啶检测氧化应激。建立尾鳍损伤模型后，分别以635nm连续波5mW氦氖激光给予3、9或18J/cm2能量密度照射，伤后120分钟内进行延时成像。比较伤后1小时与24小时图像的创面愈合百分比。结果：3J/cm2能量密度显著提升巨噬细胞迁移速度，减少迁移中途停顿次数，并表现出最强的定向迁移趋势。与对照损伤鳍相比，该能量密度组创面活性氧含量显著降低。3J/cm2和9J/cm2能量密度组的创面愈合速度均显著快于未照射对照组。结论：通过调节照射能量密度可操控创面巨噬细胞活性，从而降低创面活性氧水平并加速愈合。斑马鱼模型为实时定量比较不同激光参数下的巨噬细胞行为提供了有效手段。
关键词： 斑马鱼、巨噬细胞、氦氖激光、氧化应激、延时成像
更新于2025-09-22 21:38:33
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光感受器祖细胞依赖于gdf6a、thrβ和tbx2b的协同作用，以产生精确数量的视锥光感受器亚型群体
摘要： 目的：替换视锥光感受器（日间视觉所必需的视网膜单元）依赖于从干细胞等来源成功生成全谱系新视锥细胞。我们利用高视锥多样性的模式生物斑马鱼进行遗传学实验，绘制了视锥发育因子gdf6a、tbx2b和thrb的交互作用图谱。 方法：通过突变体基因组合、基因敲低及显性负效基因表达等技术研究目标基因，并量化视锥亚型分化结果（正常情况下这些亚型以严格调控比例发育）。 结果：gdf6a突变体出现蓝视锥细胞减少，本研究发现其红视锥细胞亦减少。gdf6a/tbx2b联合破坏时，杂合型tbx2b突变体中gdf6a缺失会导致紫外视锥细胞减少。值得注意的是，采用thrb吗啉反义寡核苷酸在gdf6a突变体中破坏thrb时，两者早期联合干扰会引发分层表型。在视网膜发育早期或晚期通过显性负效thrb（dnthrb）干扰thrb活性，对红视锥细胞（数量减少）与紫外/蓝视锥细胞（数量增加）产生差异化影响。在gdf6a突变体中使用dnthrb显示，干扰thrb活性不会改变gdf6a突变体的视锥表型。 结论：gdf6a缺失直接影响蓝视锥和红视锥细胞，并通过增强对附加干扰（如tbx2b减少）的敏感性间接影响紫外视锥细胞导致其减少。thrb效应随光感受器发育阶段变化：早期促进红视锥细胞并限制紫外视锥细胞，后期则限制紫外和蓝视锥细胞。gdf6a对紫外/蓝/红视锥发育的影响与thrb存在重叠但可能占主导地位。
关键词： BMP信号传导、祖细胞、色觉、视网膜分层、甲状腺信号传导、斑马鱼、视网膜发育、决定、再生、视锥光感受器
更新于2025-09-23 13:12:04
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颗粒蛋白1促进斑马鱼视网膜再生
摘要： 目的：视网膜退行性疾病可导致视力严重下降。通常情况下，包括人类在内的高等脊椎动物的此类损伤变化是永久性的；然而，低等脊椎动物（如两栖类和硬骨鱼类）能够实现视网膜再生?？帕５鞍浊疤迨且恢植斡胝７⒂吧丝谟瞎痰姆置谛蜕ひ蜃?。我们已证实该因子能促进小鼠视网膜中视网膜祖细胞的增殖。本研究旨在探究颗粒蛋白1（grn1）在斑马鱼视网膜再生中的作用。 方法：通过针刺损伤斑马鱼视网膜，并在不同时间点检查视网膜状态。同时采用吗啉寡核苷酸（MO）电穿孔敲低grn1表达，以及玻璃体内注射重组grn1的方法，观察视网膜再生相关基因的增殖情况及表达变化。 结果：研究表明视网膜损伤后grn1水平显著升高，且该因子在多种视网膜细胞中均有表达。grn1敲低会抑制斑马鱼视网膜再生过程中Müller胶质细胞的增殖，同时降低视网膜再生关键因子achaete-scute同源物1a（ascl1a）的表达。而玻璃体内注射重组grn1可促进Müller胶质细胞增殖，并上调ascl1a、lin28等视网膜再生相关基因的表达。 结论：这些发现表明grn1可作为刺激Müller胶质细胞去分化和视网膜再生的潜在靶点。
关键词： grn1，斑马鱼，视网膜再生，穆勒胶质细胞，颗粒蛋白前体
更新于2025-09-23 13:15:25
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[分子生物学方法] 脊椎动物胚胎发生 第1920卷（胚胎学、细胞学与遗传学方法）|| 脊椎动物胚胎中亚细胞蛋白定位与信号传导的光遗传学调控
摘要： 本章描述了在全脊椎动物胚胎的单个细胞中运用光遗传学异源二聚化技术的方法。该技术通过光照可逆地结合"锚定蛋白"与"诱饵蛋白"，从而定向调控蛋白质至特定亚细胞区室，进而改变细胞极性和信号传导等生物过程。我详细阐述了在早期斑马鱼胚胎中实现光敏色素异源二聚化系统融合蛋白瞬时表达的方法（Buckley等，Dev Cell 36(1):117–126, 2016），并说明了实现亚细胞尺度光图案化的成像参数设置。
关键词： 极性、异源二聚化、信号传导、光敏色素、光遗传学、斑马鱼
更新于2025-09-24 06:59:03