研究目的
利用活体成像系统研究成年斑马鱼皮肤血管生成过程中内皮细胞和周细胞如何建立新血管。
研究成果
成年斑马鱼的活体成像显示，皮肤损伤会立即通过VEGF信号通路诱导血管生成，形成迂曲且无序的血管网络，这些网络经过数月的退化过程逐渐正?；?。在血管生成过程中，内皮细胞和周细胞数量同步增加，周细胞在不脱离的情况下覆盖迂曲血管，这表明脱离并非出芽生长的必要条件。该系统为理解创伤性血管生成提供了基础，并可扩展用于研究参与伤口愈合的其他细胞类型。
研究不足
本研究仅以成年斑马鱼为模型，可能无法完全复现人类皮肤伤口愈合过程?；钐宄上裣低承杪樽砗凸潭ù?，或影响自然行为。部分问题（如无红细胞血管网络的特性）尚不明确，需进一步研究。巨噬细胞等其他细胞类型的作用在本研究中未充分探讨。
1：实验设计与方法选择：
建立活体成像系统以观察成年斑马鱼皮肤损伤后的血管生成反应。使用转基因斑马鱼品系通过荧光蛋白标记内皮细胞和周细胞，并采用共聚焦显微镜进行成像。
2：样本选择与数据来源：
使用多种转基因品系的成年雄性斑马鱼（如Tg(kdrl:EGFP)、Tg(flt1enh:mCherry)、Tg(gata1:DsRed)、Tg(fli1a:mCherry)、TgBAC(pdgfrb:mCherry)）。斑马鱼在标准条件下饲养繁殖，动物实验经机构委员会批准。
3：实验设备与材料清单：
设备包括FluoView FV1200或FV3000正置共聚焦显微镜（奥林巴斯）及水浸物镜（10× UMPlanFL N，0.30 NA；20× XLUMPlanFL N，1.00 NA）、蠕动泵（ATTO）、鱼缸（AS ONE塑料箱）、硅胶管（ATTO）、Intramedic聚乙烯管（BD）、精细镊子（Dumont No. 5）、Terumo 20G针头及软件（珀金埃尔默Volocity 3D成像分析软件、Adobe Photoshop）。材料包括质粒（如pTol2-fli1:mCherry）、麻醉剂（西格玛奥德里奇2-苯氧乙醇）、低熔点琼脂糖凝胶（赛默飞世尔科技）及多种转基因斑马鱼品系。
4：30 NA；20× XLUMPlanFL N，00 NA）、蠕动泵（ATTO）、鱼缸（AS ONE塑料箱）、硅胶管（ATTO）、Intramedic聚乙烯管（BD）、精细镊子（Dumont No. 5）、Terumo 20G针头及软件（珀金埃尔默Volocity 3D成像分析软件、Adobe Photoshop）。材料包括质粒（如pTol2-fli
4. 实验流程与操作步骤：将斑马鱼麻醉后固定于含琼脂糖凝胶的鱼缸中，通过含麻醉剂的水流灌注，用镊子或针头去除鳞片并制造皮肤损伤。在损伤后特定时间点使用共聚焦显微镜进行活体成像，收集血管迂曲度、出芽、分叉、修剪及细胞行为数据。
5：实验流程与操作步骤：
5. 数据分析方法：量化指标包括计算迂曲指数（测地距离与欧氏距离比值乘以方向变化次数）、统计出芽、分叉及修剪事件数量、分析细胞间距。进行统计学分析（均值、标准差、标准误），并使用指定软件处理图像。
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Confocal Microscope
FluoView FV1200
Olympus
Used for acquiring confocal Z-stack fluorescence images of cutaneous vasculature in zebrafish.
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Confocal Microscope
FluoView FV3000
Olympus
Used for acquiring confocal Z-stack fluorescence images of cutaneous vasculature in zebrafish.
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Anesthetic
2-phenoxyethanol
Sigma-Aldrich
Used to anesthetize zebrafish for immobilization during imaging and procedures.
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Agarose Gel
Low-melting-point agarose gel
Thermo Fisher Scientific
Used to immobilize zebrafish by covering trunk and tail regions during imaging.
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Software
Volocity 3D Imaging analysis software
PerkinElmer
Used for processing and analyzing confocal images.
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Peristaltic Pump
ATTO
Used to circulate fish water containing anesthetic to the fish chamber during live imaging.
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Fish Chamber
Plastic case
AS ONE
Container for mounting and imaging adult zebrafish.
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Silicone Tube
Size: 5–3
ATTO
Used for delivering and removing water in the imaging system.
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Polyethylene Tube
Intramedic
BD
Used for oral perfusion of zebrafish with water and anesthetic.
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Fine Forceps
Dumont No. 5
Used for introducing cutaneous wounds by removing scales and injuring tissue.
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Needle
Terumo Needle 20G
Terumo
Used for injuring a single capillary in the skin under confocal microscopy.
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Software
Photoshop
Adobe Systems Co.
Used for image processing.
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