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《分子生物学方法》钙信号卷1925（方法与实验方案）|| 利用光致发光探针高通量筛选检测细胞内钙水平
摘要： 水母发光蛋白（aequorin）是一种由维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）产生的22 kDa蛋白质，是首个用于测量完整细胞内特定细胞器钙离子浓度（[Ca2+]）的探针。当钙离子与三个高亲和力结合位点结合后，会发生不可逆反应并发出与[Ca2+]成正比的光子。虽然天然水母发光蛋白适用于测量细胞刺激后0.5至10 μM范围内的胞质[Ca2+]，但无法用于[Ca2+]更高的细胞器（如内质网/肌浆网（ER/SR）腔和线粒体）。然而，通过对水母发光蛋白本身或其亲脂性辅基发光团腔肠素进行修饰、添加靶向序列或与驻留蛋白融合，实现了特定细胞器的定位及细胞内钙水平的测量。近年来，多孔板读数仪的发展使得基于水母发光蛋白的高通量筛选成为可能，并克服了标准方法的一些局限性。本文介绍了在完整细胞中表达、靶向和重组水母发光蛋白，以及通过高通量筛选系统测量整体胞质、线粒体和内质网中钙离子的流程。
关键词： 细胞质、钙探针、钙离子、高通量筛选、水母发光蛋白、线粒体、内质网
更新于2025-11-21 11:20:42
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通过多途径增强磁共振/光致发光成像引导的光动力治疗
摘要： 线粒体是三磷酸腺苷（ATP）和细胞凋亡调节因子的主要来源，是促进肿瘤细胞增殖的关键细胞器，其功能障碍会影响肿瘤细胞行为。此外，线粒体被证实对原卟啉IX（PpIX）的生物合成起核心作用——这种广泛使用的光敏剂可用于肿瘤检测、监测及光动力治疗。然而外源性给药的光敏剂常受限于生物利用度不足。δ-氨基酮戊酸（δ-ALA）是天然存在的δ-氨基酸，可通过线粒体内的血红素生物合成途径原位转化为PpIX。作为PpIX前体，基于δ-ALA的光动力疗法（PDT）在癌症治疗中展现出潜力。但δ-ALA在内体系统中的蓄积会限制PpIX生成并最终影响疗效。具备内体逃逸能力的诊疗纳米颗粒（NPs）有望优化内源性生物合成效率。 本研究将具有高正电荷特性且能靶向线粒体的内体逃逸介质——三苯基膦阳离子（TPP+）修饰于δ-ALA，并进一步复合牛血清白蛋白稳定的二氧化锰（MnO2）。该体系中响应肿瘤微环境（TME）的MnO2可提升氧含量以缓解缺氧，增强的光敏剂产量与升高的氧分压共同促进最终治疗效果。此外，TME降解MnO2产生的磁共振成像增强效应（r1=5.410 s-1mM-1）可在治疗前实现精准定位引导，而源自PpIX的原位滞后光致发光成像可作为生物预后评估的监测手段。该系统性设计拓展了应用范围，凸显了光动力疗法显著的治疗前景。
关键词： 双成像纳米平台、线粒体、内源性生物合成光敏剂
更新于2025-11-21 11:08:12
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用于可视化线粒体中多硫化氢的光稳定比率型双光子荧光探针及其应用
摘要： 氢多硫化物（H2Sn）目前因其不仅在众多生物及健康相关事件中发挥重要生理功能，还被视作新发现的强效信号转导分子而备受研究关注?；谛》肿拥谋嚷市陀馓秸胨渚哂辛槊舳雀吆蜕锛觳獾挠攀?，但专门针对H2Sn检测且能靶向线粒体的此类探针仍属空白。本研究通过将三苯基膦基团引入萘酰亚胺衍生物分子骨架，成功开发出Mito-NRT-HP探针——该探针兼具优异水溶性、超强抗光漂白性、良好细胞膜穿透性和生物相容性，可清晰可视化线粒体内源性H2Sn。这种具有高选择性（LOD=0.01μM）与灵敏度的一/双光子荧光探针，在H2Sn存在时相较于其他活性硫物种（RSS）展现出70倍的荧光比值增强（I546nm/I478nm）。实验结果证实Mito-NRT-HP不仅能绘制线粒体H2Sn分布图谱并评估其在更多生物过程中的作用，还显示出在LPS诱导急性器官损伤早期诊断中的实际应用潜力。
关键词： 线粒体、荧光探针、多硫化氢、比率型、双光子
更新于2025-11-14 15:29:11
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用于检测微极性和微粘度的线粒体靶向比率荧光探针及其应用
摘要： 环境极性和粘度是影响生物分子诸多化学与生物过程的两个重要参数。在生物系统中，尤其是细胞层面，极性会影响多种蛋白质、酶的相互作用及细胞膜通透性；微环境粘度则显著影响细胞物质运输、生物大分子间相互作用、反应物质扩散等生理过程。极性和/或粘度的异常变化被认为是糖尿病、阿尔茨海默病等疾病的重要诱因或指标，其检测在多个科学领域引发广泛关注。 线粒体作为真核生物能量产生的重要细胞器及有氧呼吸主要场所，还参与蛋白质转运、ATP合成、代谢物运输等重要过程。其功能与极性、粘度、pH值和温度等理化性质密切相关，因此监测线粒体极性和/或粘度变化有助于理解重要生理过程。但传统粘度计和极性检测仪不适用于细胞水平测量，开发快速定量细胞极性与粘度的新技术具有重要需求。 基于荧光的技术因其高精度、超高灵敏度、时空分辨率及活细胞成像优势被广泛应用。目前已开发出多种基于分子内电荷转移（ICT）机制的极性敏感传感器，而具有比率荧光和/或荧光寿命成像特性的"分子转子"则是粘度检测的有前途探针。但兼具ICT特性和分子转子特性、能同步监测极性与粘度的探针鲜有报道。 香豆素是著名的极性敏感荧光团，许多基于香豆素的探针已被构建用于极性检测。分子转子的典型结构特征是通过单/双键连接的位阻基团与平面荧光团共价相连?；诖?，我们设想若将位阻基团连接至极性敏感荧光团，或可实现同步检测。本研究选取以香豆素为荧光团、N-甲基吲哚为位阻基团的YYH1和YYH2化合物来量化微环境极性与粘度。相比文献报道的类似荧光团探针，我们的探针对极性和/或粘度更敏感且发射波长更长（YYH2的λem=685nm）。两者的阳离子特性使其能定位于活细胞线粒体。 在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，YYH1和YYH2均呈现一个吸收峰和两个发射峰。短波长发射峰源自不含吲哚部分，红色发射带来自整个π共轭体系且对溶剂粘度敏感。YYH2的发射（681nm）和吸收（597nm）最大值位于红光波段（比YYH1长约30nm），更适用于生物系统。通过研究溶剂依赖的光谱特性发现：YYH1的吸收最大值从甲苯中的628nm红移至PBS中的565nm，绿色发射从462nm移至478nm；而红色发射对极性变化不敏感。YYH1的绿色发射与溶剂极性参数（ET）呈良好相关性，证实其ICT特性。由于阳离子化合物在基态极性大于激发态，其吸收波长随极性增加而减小，但绿色发射波长随极性增加而增大，表明吲哚阳离子部分未参与绿色发射。 在1,4-二氧六环-水混合体系中，随着水含量增加，YYH1和YYH2的吸收峰分别从613→565nm和647→597nm移动。YYH1的发射波长从468nm移至478nm时强度无明显变化（水含量10%-20%），继续增加水含量导致绿色发射荧光强度显著降低（无显著波长变化），而645nm发射持续增强（等发射点598nm）。两发射带超过150nm的波长差提供了比率响应，I490/I645比值随水含量增加从27骤降至0.5，表明YYH1可作为微环境极性的潜在比率荧光探针。 对于YYH2，在水含量0-40%时蓝（515nm）和红（685nm）发射均增强，进一步增加水含量则两者均减弱（图S8b,c）。荧光强度比I515/I685几乎不受水含量影响，显示YYH2对极性不敏感（图1b）。粘度测试显示：在乙二醇-水混合体系中，YYH2的红色发射比绿色发射对溶剂粘度更敏感（粘度从1.0cp增至19.9cp时，红色发射增强约10倍而绿色发射增强1.7倍），log(I685/I515)与logη呈良好线性关系，符合F?rster-Hoffmann方程。YYH2的荧光寿命也随粘度增加略有延长。而YYH1的吸收最大值随水含量增加发生约8nm蓝移，490nm和645nm荧光强度增幅相近，I645/I490比值几乎不受粘度影响（图2b）。由此可见YYH1和YYH2可分别用于检测局部极性和粘度。 活细胞实验表明：通过线粒体特异性染料共定位，YYH1（与Mitro Tracker Green FM的皮尔逊相关系数Pf达0.91-0.94）和YYH2（Pf为0.93-0.92）均能靶向线粒体。在含蛋白质的体系中，YYH1的I490/I645比值和YYH2的I685/I515比值升高，表明蛋白质存在会增加微环境粘度并降低极性。虽然不同蛋白质会导致微环境和极性差异，但传统方法难以检测半衰期短的过氧亚硝基阴离子，且细胞内亚硫酸盐含量较低（易被氧化为硫酸盐），因此这些离子的干扰可忽略。值得注意的是，虽然两种探针对亚硫酸盐的Iblue/Ired变化趋势相同，但其受极性/粘度影响的趋势差异显著，可通过双探针生物成像区分干扰。 应用测试显示：MCF-7和L929细胞与YYH1孵育后，蓝色荧光强而红色荧光弱，Iblue/Ired比值表明L929细胞线粒体极性小于MCF-7细胞；与YYH2孵育后，MCF-7细胞绿色荧光更强而L929细胞红色荧光更强，Ired/Igreen比值显示L929细胞线粒体粘度大于MCF-7细胞。 总之，我们合成了两种线粒体靶向的比率荧光探针YYH1和YYH2，分别用于定量微极性和微粘度。这两个通过C-C桥连接的香豆素（环境敏感）与N-甲基吲哚探针中，YYH1响应极性而YYH2响应粘度，为活细胞生物成像的极性/粘度荧光探针设计提供了新思路。
关键词： 线粒体、微黏度、微极性、荧光探针
更新于2025-09-23 15:23:52
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基于线粒体靶向和FRET的二氧化硫比率荧光探针及其细胞成像
摘要： 二氧化硫（SO?）被吸入体内后可与水反应生成亚硫酸根（SO?2?）和亚硫酸氢根（HSO??）离子。细胞内SO?及其衍生物的异常水平与多种疾病相关，因此监测生物体系中SO?及其衍生物的含量十分重要。迄今为止，鲜有探针能实现线粒体中亚硫酸氢盐的比率检测，且多数已报道探针响应速度缓慢，这限制了它们对SO?的实时检测应用。本研究以苯并吡喃鎓为能量受体并修饰线粒体靶向基团，开发了一种SO?荧光探针CBP。该探针对SO?表现出优异的选择性，可区分谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸及多种常见活性氧物种。识别过程中溶液颜色由紫色变为黄色，可实现SO?的"裸眼"检测。其响应极快（<1分钟），检测限低至17.7 nM。此外，探针CBP可定位于线粒体，并成功用于EC-109细胞内源性SO?的成像检测。
关键词： 荧光、细胞成像、FRET（荧光共振能量转移）、比率测量、线粒体
更新于2025-09-23 15:23:52
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用于光热治疗过程中线粒体活性氧无干扰成像与动态监测的表面增强拉曼散射纳米传感器
摘要： 对亚细胞器中活性氧（ROS）进行高可靠性检测、成像和监测，对于理解ROS的生物学作用及探究某些疾病的发病机制至关重要。本研究展示了一种无干扰的表面增强拉曼散射（SERS）活性纳米探针，用于细胞内ROS检测。该纳米探针设计为金核-银壳纳米颗粒（Au@Ag NPs），其核壳内部负载了SERS报告分子（4-巯基苯甲腈）。细胞内ROS能够蚀刻银壳，显著降低SERS报告分子的拉曼信号强度。值得注意的是，本研究所用报告分子的拉曼谱带位于细胞拉曼静默区（1800?2800 cm?1），排除了细胞分子干扰的可能性。银壳还能进一步?；けǜ娣肿用馐芙橹矢扇拧Ｍü孟吡Ｌ灏邢螂男奘文擅滋秸氡砻?，我们实现了亚细胞器（如线粒体）水平的ROS检测。并首次验证了光热治疗过程中基于SERS的线粒体ROS监测，通过SERS成像揭示了ROS分布特征。
关键词： 活性氧、线粒体、表面增强拉曼散射、光热疗法、无干扰
更新于2025-09-23 15:23:52
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红光对角膜上皮细胞存活、增殖和迁移的促进作用：与角膜伤口愈合的相关性
摘要： 本研究旨在分析短波蓝光与长波红光对体外培养的角膜上皮细胞（HCE-2）产生的差异化影响。由于室内照明及电脑、电视、手机屏幕普遍采用发光二极管（LED），原位角膜上皮暴露于蓝光的程度较以往显著增加。与黑暗环境培养组相比，低强度蓝光（如电脑屏幕发出的光线）会以剂量依赖方式降低HCE-2细胞的增殖率，高强度蓝光则导致细胞死亡。相反，高强度红光能轻微提升HCE-2细胞增殖率，更重要的是在蓝光损伤后照射可显著削弱蓝光对细胞存活的负面影响。蓝光对HCE-2细胞的毒性作用涉及线粒体功能障碍及AIF、p38-MAPK和HO-1的激活。关键的是，独立照射的红光不仅能阻断蓝光效应，还能增强线粒体功能。JC-1染色表明红光通过直接刺激线粒体功能发挥作用，从而激活多重生化机制并抑制多种死亡通路。因此，红光甚至能减轻叠氮钠对体外培养HCE-2细胞的毒性。我们对HCE-2细胞培养的研究表明：红光既可作为预防措施?；ぴ唤悄ど掀ぃ材芏钥拱ɡ豆庠谀诘亩嘀智痹诨肪乘鹕?。当角膜已受损伤（如干眼症）时，这种?；ぷ饔每赡芫哂刑厥庖庖?。
关键词： 角膜上皮细胞 – 线粒体 – 红光 – 神经?；?
更新于2025-09-23 15:22:29
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紫杉醇负载胶束（一种由PEG-TPP制备的荧光药物递送系统）的组织学及抗肿瘤活性研究
摘要： 我们合成了PEG-TPP作为载体，以胶束形式包载紫杉醇（PTX）以解决其水溶性问题。载药胶束具有周稳定性及适宜粒径（152.1±1.2 nm），有利于增强渗透滞留（EPR）效应。体外释放研究表明，胶束中PTX的释放具有显著pH依赖性。细胞水平实验显示，载药胶束能有效靶向线粒体，可能产生更优细胞毒性（尤其对MCF-7细胞，胶束IC50=0.123±0.035 μmol/L，游离PTX为0.298±0.067 μmol/L）。离体与切片器官荧光分布证实胶束可有效靶向肿瘤。此外，我们进一步证明与游离PTX相比，该胶束在荷瘤小鼠中具有更强的治疗效果。结果表明，PEG-TPP制备的可生物降解递药系统能克服紫杉醇溶解性差的问题，并提升其肿瘤靶向性与抗肿瘤活性。
关键词： PEG-TPP、线粒体、紫杉醇、EPR效应、胶束、抗癌
更新于2025-09-23 15:22:29
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光生物调节预处理可预防缺氧缺血新生大鼠模型的认知障碍
摘要： 新生儿缺氧缺血（HI）损伤是由缺氧引起的最常见致死原因及严重神经功能缺陷病因。本研究评估了光生物调节（PBM）预处理对新生大鼠HI模型脑损伤的预防效果及其作用机制。根据正常大鼠脑组织ATP水平的最佳时间响应，于HI前6小时对头皮实施PBM预处理方案（808nm连续波激光，1cm2光斑，100mW/cm2，12J/cm2）。该预处理显著减轻了HI后的认知障碍、脑体积萎缩、神经元丢失、树突和突触损伤?；蒲芯糠⑾郑篜BM预处理能恢复HI诱导的线粒体动力学异常并抑制线粒体碎片化，继而强力抑制细胞色素c释放，通过阻断caspase激活来预防神经元凋亡。本研究表明PBM预处理可通过维持线粒体动力学稳态及抑制线粒体凋亡通路来减轻HI所致脑损伤。
关键词： 缺氧缺血、线粒体、认知障碍、神经?；ぁ⒐馍锏鹘谠ご?
更新于2025-09-23 15:22:29
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基于极限学习机的LED通信系统非迭代与迭代非线性抑制方法
摘要： 线粒体中通过NADH和FADH2的氧化还原反应氧化底物生成ATP。心肌缺血再灌注（IR）损伤会损害线粒体氧化磷酸化功能。我们假设IR会改变心脏线粒体氧化还原状态的代谢异质性，这种变化仅在IR前、中、后对灌注心脏进行的三维光学冷冻成像中显现。研究包含四组心脏：时间对照（TC：无IR的灌注心脏）、全局缺血（Isch）、全局缺血后复灌（IR）以及使用线粒体解偶联剂PCP灌注的TC组。采用Langendorff离体灌注模式，在豚鼠心脏中实时记录线粒体NADH和FAD的自发荧光信号。完成各指定方案后，迅速取出心脏并液氮速冻，用于后续三维光学冷冻成像分析线粒体NADH、FAD及NADH/FAD氧化还原比（RR）。TC组心脏呈现NADH、FAD和RR的空间异质性分布。缺血和IR改变了空间分布，使RR整体分别升高55%和降低64%。PCP解偶联处理组的RR水平最低（73%氧化态），显著低于TC组。心脏三维光学冷冻成像揭示了缺血和IR期间从心基部到心尖部线粒体NADH、FAD、RR及代谢状态的异质性分布特征。这种正常与缺血心脏线粒体氧化还原状态的三维信息，在动态光谱荧光数据中无法显现。
关键词： 光学冷冻成像、氧化还原状态、代谢、缺血再灌注、线粒体
更新于2025-09-23 15:21:01