研究目的
介绍在完整细胞中表达、靶向和重构水母发光蛋白的程序，以及使用高通量筛选系统测量胞质溶胶、线粒体和内质网中Ca2+的方法。
研究成果
利用水母发光蛋白探针的高通量筛选系统，可高效测量特定细胞区室内的钙离子动态，克服了标准方法的局限性，使大规模研究钙离子通量成为可能。
研究不足
实验过程中发光蛋白不可逆消耗，因此不适用于多次钙离子瞬变检测。该方法最适合群体分析，若细胞群体不均一则可能存在偏差。需配备EnVision?系统等专用设备。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用基于水母发光蛋白的探针进行钙离子测量，通过改进实现特定细胞器靶向及多孔板读数器的高通量筛选。方法包括细胞培养、水母发光蛋白质粒转染、与腔肠素重组以及发光测量。
2：样本选择与数据来源：
以HeLa细胞为模型系统，转染编码靶向胞质（胞质AEQ）、线粒体（线粒体AEQ）或内质网（内质网AEQ）的水母发光蛋白质粒。
3：实验设备与材料清单：
包括珀金埃尔默EnVision?多标记板系统、96孔白色聚苯乙烯View Plate-96、高糖DMEM培养基、PBS、胰蛋白酶、氯化钙、HEPES缓冲盐水、KRB缓冲液、野生型及n型腔肠素、EGTA、BSA、组胺、洋地黄皂苷、离子霉素。
4：高糖DMEM培养基、PBS、胰蛋白酶、氯化钙、HEPES缓冲盐水、KRB缓冲液、野生型及n型腔肠素、EGTA、BSA、组胺、洋地黄皂苷、离子霉素。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：细胞经培养后采用磷酸钙法转染，接种于96孔板，与腔肠素重组，分别用组胺或氯化钙刺激后测量发光信号，最后用洋地黄皂苷和氯化钙释放钙离子。
5：数据分析方法：
根据Allen和Blinks算法将发光信号转换为[Ca2+]浓度，通过光发射量和总水母发光蛋白消耗量进行校准。
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EnVision multilabel plate system
EnVision
Perkin Elmer
Used for high-throughput measurement of luminescent signals from aequorin probes in multiwell plates.
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View Plate-96
96-well polystyrene white
PerkinElmer
Used for seeding cells and performing luminescence measurements in the EnVision system.
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Coelenterazine
wt and n
Prosthetic group for reconstituting active aequorin; wt for cytAEQ and mtAEQ, n for erAEQ to reduce affinity and light emission.
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Digitonin
Used in discharging solution to permeabilize cells and discharge remaining aequorin with saturating Ca2+ for calibration.
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Ionomycin
Used to empty endoplasmic reticulum of Ca2+ during erAEQ reconstitution.
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