- 标题
- 摘要
- 关键词
- 实验方案
- 产品
-
《分子生物学方法》钙信号卷1925（方法与实验方案）|| 利用光致发光探针高通量筛选检测细胞内钙水平
摘要： 水母发光蛋白（aequorin）是一种由维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）产生的22 kDa蛋白质，是首个用于测量完整细胞内特定细胞器钙离子浓度（[Ca2+]）的探针。当钙离子与三个高亲和力结合位点结合后，会发生不可逆反应并发出与[Ca2+]成正比的光子。虽然天然水母发光蛋白适用于测量细胞刺激后0.5至10 μM范围内的胞质[Ca2+]，但无法用于[Ca2+]更高的细胞器（如内质网/肌浆网（ER/SR）腔和线粒体）。然而，通过对水母发光蛋白本身或其亲脂性辅基发光团腔肠素进行修饰、添加靶向序列或与驻留蛋白融合，实现了特定细胞器的定位及细胞内钙水平的测量。近年来，多孔板读数仪的发展使得基于水母发光蛋白的高通量筛选成为可能，并克服了标准方法的一些局限性。本文介绍了在完整细胞中表达、靶向和重组水母发光蛋白，以及通过高通量筛选系统测量整体胞质、线粒体和内质网中钙离子的流程。
关键词： 细胞质、钙探针、钙离子、高通量筛选、水母发光蛋白、线粒体、内质网
更新于2025-11-21 11:20:42
-
用于检测蛋白质翻译后修饰的消化荧光"信号开启"与"信号关闭"传感器
摘要： 蛋白质翻译后修饰（PTMs）通常是酶催化产生的事件，能实现蛋白质组的功能多样化；因此，多种PTM酶已被验证为潜在药物靶点。我们先前引入了一种基于能量转移的信号调控方法——淬灭共振能量转移（QRET），并利用开发的肽键断裂技术来监测PTM的添加或去除。现在我们重新设计了QRET技术，并以肽键断裂PTM检测为例，引入了可调谐荧光"信号开启"和"信号关闭"检测方案。借助基于时间分辨荧光的单标记检测技术，我们只需引入不同的可溶性Eu3+信号调节分子，就能根据PTM添加或去除情况选择信号方向。这使得在可测量事件发生时无需任何额外标记步骤、改变检测条件或更换Eu3+报告分子，即可实现正向信号变化的选择。我们在高通量兼容的激酶和磷酸酶检测中，通过615nm处的信号开启/关闭读数或665nm处的时间分辨F?rster共振能量转移，使用四种Eu3+信号调节分子验证了该概念的可行性。数据显示，这种引入的信号调控方法提供了一种不限于PTM检测的过渡性荧光单标记检测概念。
关键词： 时间分辨荧光、信号关闭型、高通量筛选、肽键断裂技术、蛋白质翻译后修饰、荧光共振能量转移、信号开启型
更新于2025-11-19 16:56:35
-
基于荧光共振能量转移的高通量筛选法鉴定双鸟苷酸环化酶小分子调节剂
摘要： 细菌第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）是调控细胞运动性、细胞周期及生物膜形成的关键因子——这种生物膜会引发抗生素耐受性，导致慢性感染难以治疗。因此，调控c-di-GMP时空产生的二鸟苷酸环化酶可能成为控制慢性感染相关生物膜形成的理想药物靶点。我们开发了基于荧光共振能量转移（FRET）的生化高通量筛选方法，并结合详细的结构-活性研究，成功鉴定出新月柄杆菌二鸟苷酸环化酶DgcA的合成小分子调节剂。共发现七种能在微摩尔浓度范围内调控DgcA酶活性的小分子。对选定骨架的后续结构-活性研究表明其调节行为具有显著多样性，包括微量化学修饰即可使变构抑制作用逆转为激活效应。这些新发现的化合物代表全新化学型，有望开发为解析c-di-GMP信号网络及改变相关表型的化学遗传工具。本研究强调了深入探究c-di-GMP信号抑制剂作用机制的重要性，并揭示了合成小分子与调控二鸟苷酸环化酶活性的机制之间存在复杂相互作用。
关键词： 环二鸟苷酸、结构-活性关系、荧光共振能量转移、双鸟苷酸环化酶抑制剂、高通量筛选
更新于2025-09-23 15:23:52
-
红色荧光沙眼衣原体用于活细胞成像及抗菌药物筛选
摘要： 在本研究中，我们描述了一种经改造的沙眼衣原体菌株的应用——该菌株持续表达红色荧光蛋白mCherry，可用于实时监测感染周期并筛选阻断衣原体复制的活性物质。这种红色荧光衣原体菌株无需抗体染色即可自主检测，且与野生型菌株对多西环素的敏感性相当。我们利用该改造菌株和自动化荧光显微镜开发了高通量筛选方法，并采用含澳大利亚动植物天然产物的349种化合物库进行了初步筛选。对具有抗衣原体活性的化合物进行了剂量反应测试及宿主细胞毒性评估，发现两种无毒性化合物的半数有效浓度（EC50）处于低微摩尔范围。天然产物是药物研发的重要来源，所发现的衣原体生长抑制效应可能成为未来药物开发的起点。通过活细胞成像技术可动态观察红色荧光衣原体菌株的生长过程。相较于需要免疫染色的传统方法，该筛选体系降低了工作量和试剂消耗，还可用于实时监测衣原体内含体发育过程及抗衣原体效应。
关键词： mCherry（红色荧光蛋白）、抗菌、沙眼衣原体、澳大利亚天然产物、高通量筛选、基于荧光的筛选、抗衣原体
更新于2025-09-23 15:23:52
-
修改AlphaLISA激发波长可提高光合组织样本的检测灵敏度
摘要： 为高通量免疫检测筛选目的，珀金埃尔默公司的AlphaLISA技术相比传统酶联免疫吸附试验（ELISA）具有诸多优势。但其680纳米激发波长与光合色素吸收峰值波长重合，限制了该技术在植物生物技术领域的应用。在含光合基质的检测中，叶绿素受激会产生单线态氧，进而引发与色素相关的背景信号，降低检测灵敏度。本研究测试了一种经定制改造、激发波长避开光系统吸收范围的供体微球，评估其对含光合色素提取物检测灵敏度的改善效果。针对结晶结构域杀虫蛋白靶标的三项检测显示：使用定制供体微球及调整后的激发波长后，色素相关信号被消除，目标阳性与阴性样本的分离度显著提升。阴性光合提取物信号的减弱使定量检测灵敏度提高16倍。该定制供体微球在常规实验室光照下仍保持光稳定性，有望增强AlphaLISA技术的整体实用性。这种定制供体微球为植物生物技术领域提供了便捷、稳定的光合组织高灵敏度高通量免疫检测方案。
关键词： 均质的，高通量筛选，光合作用的，阿尔法，植物，高通量筛选，自动化生物学
更新于2025-09-23 15:22:29
-
基于荧光的高通量筛选技术用于天然氯离子通道阻滞剂
摘要： 氯离子通道是一类潜在的药物靶点，其阻断剂通过调节细胞凋亡、自噬等信号通路对受损细胞表现出显著保护作用。但目前尚未开发出具有氯离子通道抑制特性的临床药物。天然产物提取物因其低毒性、低成本和来源丰富，成为满足临床需求的潜在候选对象。本研究通过分子克隆构建了基于荧光报告的EYFP-H148Q/I153L-HeLa细胞系模型，并经实时定量PCR和Western Blot实验验证。利用该氯离子通道阻断剂筛选模型，从6988种天然化合物中筛选出7个具有通道阻断活性的活性化合物，随后通过电生理膜片钳技术进一步验证。本研究初步鉴定PC-4为新型氯离子通道抑制剂，并证实了基于荧光的高通量筛选技术在发现天然植物源生物活性化合物中的可靠性和灵敏性。
关键词： 天然化合物，高通量筛选，氯离子通道阻滞剂，膜片钳技术
更新于2025-09-23 15:21:21
-
用于微流控捕获阵列中液滴追踪的发光纳米材料
摘要： 高通量多重筛选平台因其能同步检测不同细胞群体的单细胞响应，在现场疾病检测与诊断领域备受关注。然而当前多数方法受限于追踪材料（如有机染料）与常用荧光团/生化染色剂之间的光谱重叠，制约了其在多重研究中的应用。本研究证实，稀土（RE）掺杂β-六方相NaYF4纳米颗粒（NPs）的下转换发射光谱可有效解决这一光谱重叠问题。与激发-发射间隔数十纳米的有机染料及其他追踪材料不同，稀土元素具有较大的激发-发射能隙，使其光谱特性独立于有机染料。作为概念验证，我们在基于荧光显微镜的液滴微流控捕获阵列中，采用两种不同掺杂的NaYF4 NPs（铕Eu3+和铽Tb3+）测试其作为光谱独立液滴追踪器的可行性。通过将Eu3+掺杂（红光发射）和Tb3+掺杂（绿光发射）NPs分别与表达绿色/红色荧光蛋白（GFP/RFP）的基因改造癌细胞系、以及经乙锭同二聚体染色的活/死细胞混合群体共包裹，成功表征了其发光追踪特性。通过对发光信号与荧光信号的定量分析，证实各NPs之间及NPs与细胞间均无光谱重叠。因此，Eu3+与Tb3+掺杂NPs彼此之间及与常见荧光团的光谱独立性，凸显了该技术在多重检测系统中的应用潜力——可通过多种发光NPs（其他掺杂/共掺杂NPs）在同一平台上同步追踪不同输入条件。
关键词： 稀土元素，单细胞分析，纳米粒子，微流控技术，高通量筛选
更新于2025-09-23 15:21:21
-
机器学习加速新型二维光伏材料的发现
摘要： 寻找新型高性能二维光伏（2DPV）材料是太阳能电池应用领域的重要研究方向。本研究开发了一种基于机器学习算法与高通量筛选相结合的高效方法，从187093种已实验鉴定的无机晶体结构中成功筛选出26种2DPV候选材料，并通过密度泛函理论计算预测了其转换效率。结果表明，Sb2Se2Te、Sb2Te3和Bi2Se3的转换效率显著高于其他材料，使其成为极具应用前景的2DPV候选材料。随后我们分析了这些材料的优异光伏性能，建立了与光伏特性相关的潜在结构关系，为进一步研究2DPV材料提供了重要依据。鉴于材料数据库的快速发展，该方法不仅为寻找新型2DPV材料提供了高效途径，还可应用于多种功能材料的探索。
关键词： 高通量筛选、机器学习、太阳能电池应用、密度泛函理论、二维光伏材料
更新于2025-09-23 15:19:57
-
使用BODIPY标记的ATP类似物开发和验证基于荧光偏振的激酶抑制剂筛选分析方法
摘要： 筛选化合物库以识别特定生物靶点的小分子调节剂，在发现新型治疗药物和分子探针的过程中至关重要?？悸堑叫枰芗嗖?#34;所有"激酶的简易单工具检测技术，我们开发了一种基于荧光偏振(FP)的检测方法来监测蛋白激酶与ATP的结合能力。我们使用BODIPY ATP-γ-S作为探针，通过测量光束穿过样品时偏振度的变化来进行检测。利用商业化的蛋白激酶A(PKA)，我们成功优化了该检测方法——当反应体系中加入H7时，能有效抑制探针的结合。此外，我们采用高通量方式应用该检测方法，并验证了对一组预测可对接至PKA ATP结合位点的小分子的筛选效果。这将有助于通过阻断ATP结合来筛选可能靶向蛋白激酶的更大规?；衔锟?。
关键词： 高通量筛选、ATP结合位点、蛋白激酶、荧光偏振、BODIPY ATP-γ-S
更新于2025-09-23 15:19:57
-
通过快速激光质谱技术对生物合成文库进行离群筛选
摘要： 借助DNA合成与分子克隆技术的进步，合成生物学日益采用大规模构建文库来探索广阔的设计空间。对于生物合成途径工程而言，筛选这些文库以获取多种目标代谢产物的能力至关重要。若目标代谢物或代谢表型难以测量，筛选工作很快就会成为涉及耗时培养、样本制备和提取的主要瓶颈。为此，我们展示了自动化激光辅助快速蒸发电离质谱技术（LA-REIMS）——一种环境激光解吸电离质谱技术——如何无需样本制备或提取，直接对琼脂平板上的酵母菌落进行快速质谱分析。我们利用LA-REIMS以每分钟6个菌落的速度，直接评估酵母菌落中紫罗兰素和桦木酸的生产水平。随后，我们通过不到4小时筛选450多个酵母菌落，同时实时生成每个菌落的可回收甘油菌种，展示了LA-REIMS的高通量能力。这证明LA-REIMS可作为液相色谱-质谱联用（LCMS）等下游定量方法的预筛选工具。通过LA-REIMS预筛选数百个菌落，我们成功分离并验证了一个桦木酸产量提高2.5倍的菌株。最后，我们证明LA-REIMS能检测27种不同生物分子中的20种，展示了该技术在代谢物检测中的广泛应用性。LA-REIMS的快速自动化特性使其成为补充当前学术和工业流程中现有筛选技术的宝贵新技术。
关键词： 合成生物学、代谢工程、快速蒸发电离质谱、环境质谱、高通量筛选
更新于2025-09-19 17:13:59