研究目的
通过调整激发波长以避免光合色素的干扰，从而提高AlphaLISA免疫分析法对光合组织样本的灵敏度。
研究成果
使用定制的775纳米供体微珠可消除光合组织AlphaLISA检测中的色素相关背景信号，使灵敏度提升16倍并增强环境光下的光稳定性，适用于植物生物技术的高通量筛选。
研究不足
该研究仅限于特定的杀虫蛋白靶标和植物组织（玉米和大豆）。定制供体微珠需要改装检测器，可能并非普遍可用。样本提取和色素含量的差异可能影响重现性。
1：实验设计与方法选择：
该研究通过比较传统680纳米供体微球与定制775纳米供体微球在AlphaLISA检测中的应用，以消除光合组织提取物中与色素相关的背景信号。理论模型包含叶绿素激发产生单线态氧的机制。
2：样本选择与数据来源：
采集玉米和大豆的叶片及根系组织进行提取并作为样本。制备阴性对照与阳性样本，采用参考方法对总蛋白进行定量。
3：实验设备与材料清单：
设备包括Geno/Grinder 2010研磨仪、离心机、酶标仪（BMG PHERAstar FS及改装版PerkinElmer EnSpire）和液体处理系统。材料包含AlphaLISA受体微球、供体微球（680纳米与775纳米）、提取缓冲液、抗体及各类实验室耗材。
4：实验流程与操作步骤：
样本经机械法提取，在384孔板中设置检测体系并通过自动化移液器添加试剂，经孵育后使用相应检测器读取数据。光稳定性测试通过将供体微球暴露于环境光下完成。
5：数据分析方法：
采用信噪比、阴性对照与缓冲液比值、标准曲线插值及变异系数等统计指标进行分析，利用二次拟合系数进行定量计算。
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AlphaLISA acceptor beads
6772002
PerkinElmer
Used in sandwich immunoassays to bind target proteins and generate chemiluminescent signal upon excitation.
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AlphaScreen streptavidin donor beads
6760002
PerkinElmer
Traditional donor beads excited at 680 nm to generate singlet oxygen for signal detection.
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AlphaScreen streptavidin donor beads
6760011
PerkinElmer
Customized donor beads excited at 775 nm to avoid photosynthetic pigment interference.
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Tween-20 detergent
P9416
Sigma-Aldrich
Detergent added to extraction buffer for leaf samples.
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NHS-PEG4-Biotin
21329
Thermo Fisher Scientific
Used for biotinylation of antibodies.
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AlphaLISA assay buffer
AL000F
PerkinElmer
Diluent for assay reagents.
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ProxiPlate
6008280
PerkinElmer
White 384-well plate for AlphaLISA reactions.
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Geno/Grinder
2010
SPEX SamplePrep
Mechanical grinder for sample extraction.
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BMG PHERAstar FS
BMG Labtech
Plate reader for detecting AlphaScreen signals with 680 nm excitation.
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EnSpire multimode plate reader
PerkinElmer
Modified plate reader for detecting signals with 775 nm excitation.
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Multidrop Combi reagent dispenser
Thermo Fisher Scientific
Automated dispenser for adding reagents in assays.
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Spectramax Plus 384 absorbance plate reader
Molecular Devices
Used to measure absorbance of samples at 680 nm.
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Titer tubes
84501XNBZQ
Quality Scientific Plastics
Used for sample storage and extraction.
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Polycarbonate vial
04-240-05
OPS Diagnostics
Used for storing root tissue samples.
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Chloride-phosphate mixture
PW0002-30
EMD Millipore
Extraction buffer component.
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Stabilzyme Select
SZ03
Surmodics Inc.
Used in standard curve preparation for protein quantification.
-
Light filter
R389
Rosco Laboratories Inc.
Green-filtered fluorescent lighting to protect light-sensitive reagents.
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