研究目的
利用视网膜类器官诱导平台丰富和扩增hiPSC-RPE，并探索连续传代RPE细胞的特性。
研究成果
该研究开发了一种简单的RPE球体形成方法，在通用视网膜类器官诱导平台上富集并扩增与视网膜神经元共同生成的人诱导多能干细胞来源视网膜色素上皮（hiPSC-RPE）细胞。成功培育可扩增的RPE细胞将降低视网膜细胞治疗（尤其是个性化医疗）中视网膜细胞制备的成本。
研究不足
在不同细胞系和实验批次中观察到RPE球体产量的差异。需要进一步研究来优化临床级视网膜细胞的制备方案，并探索其作为视网膜疾病治疗来源的有效性和安全性。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用已发表的视网膜类器官诱导方案并稍作修改。将hiPSCs分化为RPE细胞谱系，在神经视网膜剥离后，剩余混合物进行悬浮培养以形成RPE球体。分离RPE片层并进行消化扩增。
2：样本选择与数据来源：
本研究使用了三种hiPSC细胞系。
3：实验设备与材料清单：
hiPSCs在Matrigel包被的培养皿中采用mTeSR1培养基维持培养。
4：实验流程与操作步骤：
hiPSCs解离后培养形成胚状体，随后重铺于含神经诱导培养基的Matrigel包被培养皿。第4至5周后，RPE和神经视网膜区域形成并准备剥离。刮取剩余混合物进行悬浮培养以形成RPE球体。
5：数据分析方法：
通过免疫组织化学、透射电镜、吞噬实验、TER测量、ELISA检测VEGF分泌、RT-PCR和定量RT-PCR以及流式细胞术等不同检测方法评估扩增后RPE细胞的细胞、分子及功能特征。
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Matrigel coated plates
354277
Corning, Inc.
Culture of hiPSCs
-
Dispase II
D4693
Sigma-Aldrich Corp.
Dissociation of RPE spheroids
-
mTeSR1 medium
05851
STEMCELL Technologies
Maintenance of hiPSCs
-
DMEM/F12
Neural induction medium
-
N2 supplement
Invitrogen Corp.
Neural induction medium component
-
minimum essential media non-essential amino acids
Neural induction medium component
-
heparin
Sigma-Aldrich Corp.
Neural induction medium component
-
B27
Invitrogen
Retinal differentiation medium component
-
penicillin-streptomycin
Retinal differentiation medium component
-
TrypLE Express
12605-010
Life Technologies
Digestion of RPE sheets into single cells
-
CM-Dil
C7001
Invitrogen
Labeling of photoreceptor outer segments
-
VEGF ELISA kit
CSB-E11718h
Abbkine Scientific
Measurement of VEGF secretion
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TRIzol Reagent
15596026
Invitrogen
RNA extraction
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LSRFortessa Flow Cytometer
BD
Flow cytometry analysis
-
FlowJo
7.6.1
Data analysis for flow cytometry
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GraphPad Prism Software
6.01
GraphPad Software, Inc.
Statistical analysis
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