1：实验设计与方法选择：

本研究采用二维红外（2D IR）光谱技术，以高时空分辨率测量构象异质性与动态变化。探针对氰基苯丙氨酸（CNF）被选择性引入Src同源结构域3（SH3）的六个不同位点，作为其蛋白质微环境的探针。

2：样本选择与数据来源：

CNF标记的SH3Sho1和pPbs2分别通过琥珀抑制法和Fmoc固相肽合成法制备。用于2D IR光谱分析的样本包含4 mM SH3Sho1（研究未配体状态）或4 mM SH3Sho1与4.8 mM pPbs2（研究复合物状态），溶剂为50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0，含100 mM NaCl）。

3：8 mM pPbs2（研究复合物状态），溶剂为50 mM磷酸钠缓冲液（pH 0，含100 mM NaCl）。 实验设备与材料清单：

3. 实验设备与材料清单：研究使用了傅里叶变换红外光谱（FT IR）、二维红外光谱（2D IR）、可见光光谱、圆二色谱或荧光光谱。二维红外光谱采用常规BOXCARS几何构型进行。

4：实验流程与操作步骤：

通过时间依赖的二维红外光谱中心线斜率（CLS）分析结合线性光谱拟合，确定傅里叶变换相关函数（FFCF）。所有实验均采用独立制备的样本进行三重重复。

5：数据分析方法：

采用Kubo模型分析光谱动力学，分离FFCF的均匀与非均匀贡献。中心线斜率（CLS）分析可良好近似归一化FFCF的非均匀部分。