研究目的
为开发一种优化的三光子显微镜，用于清醒小鼠的深层组织功能成像，克服双光子显微镜的局限性，并表征皮层各层及皮层下神经元的视觉反应。
研究成果
优化后的三光子显微镜可在低激光功率下对清醒小鼠进行无损伤的深层组织功能成像。该技术揭示了皮层各层以及首次在皮层下神经元中呈现出的独特视觉反应特性：第5层神经元调谐范围更广，第6层神经元调谐更敏锐，而皮层下神经元反应较弱。这一进展推动了活体神经科学研究，并为皮层信息处理机制提供了新见解。
研究不足
该研究仅限于小鼠模型和特定皮层区域（V1）。显微镜设计可能不直接适用于其他组织或物种。高重复频率可能增加加热风险，必须谨慎控制脉冲能量以避免损伤。该方法需要专业设备和专业知识。
1：实验设计与方法选择：
设计了一台定制的三光子显微镜，采用优化的激光参数（1300纳米波长、40飞秒脉冲宽度、800千赫兹重复频率）以实现深度成像。使用Zemax软件进行光学建模，并加入了预啁啾系统和延迟线以提升性能。
2：样本选择与数据来源：
使用了2至6个月大的成年小鼠（包括雌雄），包括Thy1-GFP M系和野生型C57BL6小鼠。注射AAV2/1.Syn.GCaMP6s.WPRE.SV40病毒以标记V1区的神经元。
3：Syn.GCaMP6s.WPRE.SV40病毒以标记V1区的神经元。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：飞秒激光器（Spirit，Spectra Physics）、非线性光学参量放大器（NOPA，Spectra Physics）、振镜（6215H，Cambridge Technologies）、物镜（XLPN25XWMP2，Olympus）、光电倍增管（H7422A-40和R7600U-200，Hamamatsu）、扫描与管镜、电动载物台（MMBP，Scientifica）以及各种光学元件（如波片、二向色镜）。
4：实验流程与操作步骤：
在小鼠上进行了开颅手术和病毒注射。通过视觉刺激（定向光栅）进行活体成像，成像深度可达1000微米。利用激光消融进行光学特性测量和层标记。使用ScanImage软件获取图像。
5：数据分析方法：
使用ImageJ和MATLAB中的自定义脚本分析图像。计算了方向选择性指数（gOSI、OSI、DSI）并进行了统计检验（t检验、正态性检验）。
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Photomultiplier tubes
H7422A-40
Hamamatsu
Detect GCaMP6s, GFP, and retrobeads fluorescence signals.
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Photomultiplier tubes
R7600U-200
Hamamatsu
Detect THG signal.
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Half-wave plate
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Thorlabs
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Polarizing cube beam splitter
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Control laser power with high extinction ratio.
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FF705-Di01
Semrock
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Laser blocking filter
FF01-670/SP
Semrock
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Nonlinear imaging filter
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Semrock
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Semrock
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Objective lens
XLPN25XWMP2
Olympus
High transmission objective for deep imaging.
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Femtosecond laser
Spirit
Spectra Physics
Pump laser for generating ultrashort pulses at 1045 nm to pump the NOPA.
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Noncollinear optical parametric amplifier
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Spectra Physics
Generates excitation wavelength of 1300 nm for three-photon imaging.
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Galvanometric mirrors
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Cambridge Technologies
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Scienti?ca
Position mice and objective for imaging.
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