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结合激光捕获显微切割与微流控qPCR分析单细胞转录谱：阿片类药物依赖的系统生物学研究方法
摘要： 解剖学上相邻的单细胞存在显著的转录异质性，这表明稳健的组织功能可能通过细胞表型多样性实现。研究生物系统网络动力学的单细胞实验，以具有生物学意义的分辨率展示了细胞和组织对各种条件的响应。在此，我们阐述从解剖学特定位置获取单细胞并精确测量其部分基因表达谱的方法。我们将激光捕获显微切割（LCM）与微流控逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）相结合。我们还利用该微流控RT - qPCR平台测量肠道内容物的微生物丰度。
关键词： 单细胞基因表达、杏仁核、肠道菌群、解剖特异性、胶质细胞、激光捕获显微切割、阿片类药物依赖、遗传学、微流控qPCR
更新于2025-09-23 15:21:01
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利用激光捕获显微切割技术对福尔马林固定石蜡包埋人黑质组织进行蛋白质组定量分析
摘要： 激光捕获显微切割技术（LCM）能够从异质性组织标本中可视化并分离出形态学上不同的细胞亚群。结合甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织，该技术为健康与疾病状态下组织蛋白质的回顾性及临床相关研究提供了有力工具。我们首先优化了FFPE组织标本高效LCM分析的实验方案，采用含SDS的提取缓冲液配合单罐固相增强样本制备（SP3）消化法，在蛋白质得率及肽段鉴定数量上获得了最佳结果。随后通过串联质谱标签（TMT）标记和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对显微切割的人脑黑质组织样本（约3000个细胞）进行分析，成功定量了超过5600个蛋白质组。通过对黑质蛋白质按丰度分类分析，发现高丰度蛋白质中富含细胞外囊泡和神经元特异性基因本体（GO）条目。采用无标记鸟枪法比较显微切割样本与完整组织切片时，发现酪氨酸羟化酶、α-突触核蛋白等神经元标志物以及具有神经元特异性GO注释的蛋白质呈现富集。本研究完整建立了基于FFPE组织的激光捕获蛋白质组学技术流程，证实了低样本量条件下通过LCM分离特定细胞亚群进行蛋白质组分析的高效性。
关键词： TMT标记、液相色谱-串联质谱、蛋白质组学、黑质、福尔马林固定石蜡包埋组织、激光捕获显微切割
更新于2025-09-19 17:13:59
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基于紫外线和红外线的激光显微切割技术对激光显微切割-反相蛋白芯片工作流程中磷酸化蛋白检测的影响
摘要： 可逆的蛋白质磷酸化是真核细胞中信号传导的关键机制。磷酸化失调也是癌症发生的标志，在精准医疗领域是重要的药物靶点。因此，在临床组织分析中保持磷酸化蛋白完整性的方法对癌症研究至关重要。本研究探讨了紫外激光显微切割（UV LMD）和红外激光捕获显微切割（IR LCM）对反向蛋白微阵列（RPPA）检测的关键癌症信号蛋白靶点磷酸化丰度的影响。从四例高级别浆液性卵巢癌获取的连续薄切片中，分别采用UV LMD和IR LCM方法获取肿瘤上皮细胞。通过RPPA检测十种重要药物靶点磷酸化蛋白的丰度，结果显示高能量紫外激光法与低能量红外激光法获得的磷酸化蛋白完整性无显著差异。
关键词： 反向蛋白芯片、磷酸化蛋白、蛋白质组学、激光捕获显微切割、激光显微切割
更新于2025-09-19 17:13:59
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小鼠胚胎软骨和骨组织的激光捕获显微切割用于基因表达分析
摘要： 激光捕获显微切割技术（LCM）是从异质性组织中分离特定细胞类型或目标区域的有力工具。骨骼成分的细胞与分子复杂性随发育过程而增加。组织异质性（如软骨与骨成分之间、或它们与周围组织交界处）是研究发育中软骨与骨骼的障碍之一。本方案提供了一种快速的组织处理与分离方法，能获得适用于基因表达分析的高质量RNA。通过冷冻小鼠胚胎组织切片，并采用短暂甲酚紫染色使软骨与骨呈现区别于周围组织的颜色，随后快速脱水并通过LCM分离软骨与骨。该过程中最大限度减少水溶液接触以维持RNA完整性。成功采集了E16.5小鼠梅克尔软骨与下颌骨，基因表达分析显示成骨细胞、骨细胞、破骨细胞及软骨细胞的标志基因存在差异表达。该方法还能从多种组织及不同胚胎发育阶段获取高质量RNA。本方案详述了LCM样本制备流程，包括新鲜冷冻组织的冰冻包埋、切片、染色与脱水，以及通过LCM精准分离软骨与骨以获得适用于转录组分析的高质量RNA。
关键词： RNA测序、下颌骨、发育生物学、甲酚紫、RNA分离、梅克尔软骨、激光捕获显微切割
更新于2025-09-16 10:30:52
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优化激光捕获显微切割方案以分离下颌髁突软骨的区特异性细胞群
摘要： 下颌髁突软骨（MCC）是一种由纤维区（FZ）、增殖区（PZ）、成熟区（MZ）和肥大区（HZ）组成的多区域异质性纤维软骨。对整体组织进行粗采样可能掩盖重要信息并影响分子分析的有效性。激光捕获显微切割（LCM）技术能分离区域化（均质）细胞群，从而获得更精确的分子遗传数据，但组织制备和显微切割过程中的挑战在于：既要获得允许组织学识别目标细胞类型的可接受切片形态，又要最大限度减少RNA降解。因此，我们旨在优化LCM方案，从MCC各区域分离四种均质化区域特异性细胞群，同时保持RNA回收质量。 从5周龄雄性Sprague-Dawley大鼠获取MCC和股骨髁突软骨（FCC）标本，制备甲醛固定与未固定冷冻切片并进行组织学对比。另取标本分别显微切割FCC及MCC各区域制备LCM样本。通过定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）计算甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和β-肌动蛋白（β-Actin）的3'/m比值评估LCM-RNA完整性。固定与未固定切片均能可靠识别MCC区域，本方案优化的冷冻切片形态扩大了可分离细胞类型范围。在经验性设定的LCM参数下，四种均质细胞群高效分离自对应区域。GAPDH和β-Actin的3'/m比值均值分别为1.11-1.56和1.41-2.12，符合报道的质量控制要求。研究表明优化后的LCM方案可从MCC分离四种均质化区域特异性细胞群，同时保持满足后续分子分析高质量要求的RNA完整性，从而获得精确的分子遗传数据。
关键词： RNA完整性、激光捕获显微切割、下颌髁突软骨、区域特异性细胞群、分子分析
更新于2025-09-16 10:30:52
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一种利用激光捕获显微切割技术对匹配的原发性和转移性结直肠肿瘤进行转录组分析的优化方案
摘要： 随着下一代测序（NGS）技术的改进，如今生成大量基因组数据既可行又具有成本效益。核糖核酸测序（RNA-Seq）正成为全面表征全局转录组活性的首选方法。减瘤手术（CRS）具有独特优势，可系统性地获取多个空间离散的肿瘤标本进行基因组分析。为促进此类下游分析，可采用激光捕获显微切割（LCM）技术获取纯细胞群。本方案研究旨在开发一种方法学，通过利用LCM分离纯细胞群，从匹配的原发肿瘤和转移瘤中获取高质量表达数据。我们展示了一种优化的LCM方案，该方案可重复性地提供用于RNA测序和定量聚合酶链反应（qPCR）的完整RNA。在对正常上皮、肿瘤和基质成分进行病理注释后，LCM结合cDNA文库构建成功实现了RNA测序。为阐明本框架在识别常规整体肿瘤测序可能遗漏靶标方面的潜力，我们通过qPCR和免疫组织化学技术验证表明，所鉴定的基因确实仅在特定亚组分中表达。本研究表明，将匹配的组织标本与组织显微切割及NGS相结合，为揭示隐藏生物标志物提供了可行平台，并以更高分辨率洞察肿瘤生物学特性。
关键词： RNA测序、激光捕获显微切割、结直肠肿瘤、转录组分析、库肯勃瘤
更新于2025-09-16 10:30:52
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一种从新鲜冷冻小鼠骨骼中获取高质量RNA的激光捕获显微切割方案
摘要： RNA产量和完整性对RNA分析至关重要。然而，在整个激光捕获显微切割（LCM）过程中保持RNA完整性往往存在技术挑战。由于LCM研究处理的样本量极少，RNA产量有限的问题也备受关注。因此，本研究开发了一套LCM操作流程，旨在获取足量高质量RNA用于骨细胞基因表达分析。我们评估了染色方案、冰冻切片厚度、显微切割组织量、RNA提取试剂盒及所用LCM系统对显微切割骨细胞RNA产量和完整性的影响。采用粘附薄膜制备8微米厚冰冻骨切片，并使用商业LCM染色剂的快速方案进行染色。样本夹在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜与粘附薄膜之间，通过重力收集样本的LCM系统和基于柱式的RNA提取方法，最终获得产量充足且质量优异的RNA。虽然本研究聚焦于小鼠股骨切片，但所述LCM流程可用于研究生理状态及疾病进程中任何硬组织细胞的原位基因表达。
关键词： 第151期，骨骼，基因表达，激光捕获显微切割，小鼠，RNA，RNA完整性数值，生物学
更新于2025-09-12 10:27:22
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利用激光捕获显微切割和Smart-3SEQ技术对存档组织单细胞进行基因表达谱分析
摘要： RNA测序（RNA-seq）是量化基因表达的灵敏且精确的方法。小样本或RNA降解的样本（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织）使用非专业RNA-seq方案研究仍具挑战性。我们在此提出一种新方法Smart-3SEQ，该方法即使使用微量总RNA也能准确量化转录本丰度，并能有效表征通过激光捕获显微切割（LCM）从FFPE组织中提取的小样本。我们还从以往RNA-seq方案无法研究的FFPE单细胞中获取了独特的生物学特征，并利用这些数据鉴定出可能与肿瘤微环境相关的新巨噬细胞表型。我们认为Smart-3SEQ是一种极具成本效益的方法，可开展不受样本量和组织可用性限制的大规模基因表达谱分析实验。特别是，Smart-3SEQ与FFPE组织的兼容性释放了大量存档临床样本的潜力；结合LCM技术，它能实现对原位环境下分离的小细胞群和单细胞前所未有的研究。
关键词： 激光捕获显微切割、单细胞基因表达、RNA测序、肿瘤微环境、福尔马林固定石蜡包埋组织、Smart-3SEQ
更新于2025-09-11 14:15:04
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超越H&E染色：用于原位组织生物标志物成像的先进技术
摘要： 数十年来，常规苏木精-伊红染色的组织病理学一直是并将继续作为人类和兽医物种组织样本形态学诊断的金标准。然而过去十年间，原位组织生物标志物成像的先进技术呈指数级增长，弥合了解剖病理学与分子病理学之间的鸿沟。如今已能同步观测组织切片中多种蛋白质、核酸及分子靶标的定位与表达强度，并运用机器学习整合海量图像衍生数据集。随着这些技术日益精密化和普及化，组建包含医学、工程学和物理学背景专科人员的团队科学模式，对于保障此类数据生成研究的质量与有效性至关重要。本文旨在详述当前组织切片中最主要先进成像技术的科学原理、工具与培训、质量控制以及数据采集分析要点：包括免疫荧光、原位杂交、激光捕获显微切割、基质辅助激光解吸电离成像质谱以及光谱/光学方法。文末简要展望了离体与活体成像技术的未来发展方向。
关键词： 激光捕获显微切割、免疫组织化学、质量控制、原位杂交、生物标志物、分子病理学、荧光显微镜技术、基质辅助激光解吸电离（MALDI）
更新于2025-09-10 09:29:36