研究目的
开发一种新方法Smart-3SEQ，用于利用少量总RNA和降解RNA样本准确量化转录本丰度，并通过激光捕获显微切割技术实现存档FFPE组织中单细胞的基因表达谱分析。
研究成果
Smart-3SEQ是一种极具成本效益的基因表达谱分析方法，对降解RNA具有强耐受性且兼容FFPE组织。结合激光捕获显微切割技术（LCM），它能实现对微小细胞群和单细胞前所未有的研究，揭示肿瘤微环境中新的巨噬细胞表型。
研究不足
LCM方法劳动强度大，限制了可收集的细胞数量。FFPE材料中的RNA质量会随时间推移而下降，影响数十年样本的数据质量。除非靠近基因末端，否则该方法无法报告剪接或基因型信息，且无法检测非多聚腺苷酸化转录本。
1：实验设计与方法选择：
本研究结合了模板转换SMART方法和Smart-seq2的方案优化，以及3SEQ的简化3'端靶向策略，通过引入独特分子标识符来提高低起始量下的转录本计数准确性。
2：样本选择与数据来源：
研究使用参考RNA（ERCC混合液1和2、人脑参考RNA和通用人参考RNA）以及来自导管原位癌（DCIS）乳房切除标本的FFPE组织样本。
3：人脑参考RNA和通用人参考RNA）以及来自导管原位癌（DCIS）乳房切除标本的FFPE组织样本。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：包括ArcturusXT激光捕获显微切割系统、CapSure HS LCM捕获盖、RNeasy FFPE试剂盒、Agilent生物分析仪、Illumina NextSeq 500和MiSeq测序仪。
4：实验流程与操作步骤：
RNA经片段化处理后，使用oligo(dT)引物进行逆转录，并通过Smart-3SEQ方法测序。采用激光捕获显微切割技术从FFPE组织中分离单细胞和批量样本。
5：数据分析方法：
使用NovoAlign和STAR将读段比对至参考序列，通过featureCounts量化转录本丰度，并采用DESeq2进行差异基因表达分析。
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获取完整内容-
CapSure HS LCM Cap
LCM0215
Thermo Fisher Scientific
Used with the ArcturusXT LCM System for capturing microdissected cells.
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ArcturusXT LCM System
Thermo Fisher Scientific
Laser-capture microdissection system for isolating specific cells from tissue samples.
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RNeasy FFPE Kit
73504
Qiagen
RNA extraction kit for FFPE tissue samples.
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Agilent Bioanalyzer
Agilent Technologies
Used for RNA quality assessment.
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Illumina NextSeq 500
Illumina
High-throughput sequencing instrument.
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MiSeq
Illumina
Sequencing instrument used for testing the effect of read lengths.
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