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CRISPR/Cas9编辑的患者源性视网膜色素上皮细胞功能评估
摘要： 色素性视网膜炎是最常见的遗传性失明形式，可由多种导致相似表型的基因突变引起。具体而言，普遍表达的剪接因子蛋白突变已知会导致该病的常染色体显性遗传型，但这些突变的视网膜特异性病理机制尚不明确。我们利用携带PRPF8剪接因子错义突变的剪接因子型视网膜色素变性患者成纤维细胞，制备了三个患病和三个经CRISPR/Cas9校正的诱导多能干细胞(iPSC)克隆。通过定向分化将这些克隆分别诱导为视网膜色素上皮(RPE)细胞，并从基因/蛋白表达、顶底极性及吞噬能力等方面进行分析。结果表明：患者源及校正后的细胞均可生成RPE细胞，其体外形态与功能与野生型RPE细胞相似但不完全相同；功能上，这些RPE细胞建立顶底极性及吞噬光感受器外节段的能力与野生型细胞相当。这些数据提示：无论患病还是校正的患者源iPSC，都能分化出表型接近正常且吞噬功能无差异的RPE细胞——该结论与既往小鼠模型不同。现可利用这些RPE细胞建立与视网膜色素变性相关的"疾病类器官"研究系统。
关键词： 视网膜色素上皮细胞、CRISPR/Cas9、视网膜色素变性、PRPF8、诱导多能干细胞
更新于2025-09-23 15:23:52
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利用全光学电生理技术对人诱导多能干细胞来源的兴奋性神经元进行本征兴奋性的可扩展测量
摘要： 诱导多能干细胞（iPS细胞）为在人类遗传背景下体外模拟神经系统疾病提供了令人振奋的机遇。尽管基于iPS细胞的疾病模型研究已取得显著进展，但仍亟需建立能够高通量表征单个神经元电生理特征的技术，以实现对疾病表型和药物调控作用的统计学稳健评估。本文介绍的Optopatch平台技术利用光遗传学同时刺激并记录人源iPS细胞衍生的兴奋性神经元动作电位（APs），其信息量与手动膜片钳电生理技术相当，但通量提高约三个数量级。我们采用NGN2转录编程方法生成皮层兴奋性神经元，并在啮齿类胶质细胞共培养体系中培育。通过免疫细胞化学和qRT-PCR检测发现，该神经元制备物富含神经元标志物、谷氨酸能标志物及特定离子通道。通过使用奎尼丁和瑞替加滨等离子通道调节剂进行药理学评估，我们测量了动作电位发放时序和波形特性的变化，从而验证了该固有细胞兴奋性检测技术的规?；τ们绷?。基于人源iPS细胞衍生皮层兴奋性神经元的Optopatch平台，可实现对细胞表型与药理作用的精细评估，为药物研发和表型筛选中的细胞疾病模型探索奠定基础。
关键词： 电生理学、光遗传学、诱导多能干细胞
更新于2025-09-23 15:23:52
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聚苄基谷氨酸生物相容性支架可提升人诱导多能干细胞向视网膜神经节细胞谱系分化的效率
摘要： 视神经病变是视网膜神经节细胞（RGC）退化导致不可逆失明的主要原因之一。诱导多能干细胞（iPSC）疗法的发展为RGC退化开辟了治疗窗口，而组织工程学可进一步提升iPSC分化过程的效率。本研究旨在评估新型仿生聚谷氨酸苄酯（PBG）支架对培养iPSC来源的RGC祖细胞的效果。在PBG支架上培养的iPSC衍生神经球增加了视网膜神经元的分化数量，并促进了RGC祖细胞层的神经突生长。此外，与同期在盖玻片上培养的iPSC相比，PBG支架上的iPSC形成了类器官结构。通过RNA测序发现，PBG组细胞向视网膜谱系分化，可能与谷氨酸信号通路相关。进一步的本体分析和基因网络分析显示，PBG组与对照组之间的差异表达基因主要与神经元分化、神经元成熟相关，更具体地说，与视网膜分化和成熟相关。这种新型电纺PBG支架有利于培养iPSC来源的RGC祖细胞及视网膜类器官。与盖玻片培养的细胞相比，PBG支架上的细胞分化更有效，并缩短了RGC分化的过程。这一新培养系统可能有助于未来的疾病建模、药物筛选、自体移植，并缩小与临床应用的差距。
关键词： 诱导多能干细胞、视网膜神经节细胞、组织工程、青光眼、视神经病变、聚谷氨酸苄酯、电纺支架
更新于2025-09-23 15:22:29
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生成iPSC来源的脉络膜内皮细胞以研究年龄相关性黄斑变性
摘要： 目的：年龄相关性黄斑变性（AMD）是西方世界导致不可逆失明的最常见原因，其特征为脉络膜内皮细胞（CECs）、视网膜色素上皮细胞（RPE）和光感受器细胞功能失调并最终死亡。目前基于干细胞的治疗策略——旨在替换光感受器和RPE细胞——是主要科研焦点。但这些方法的成效可能还需替换其下层起支撑作用的脉络膜血管系统。本研究旨在生成干细胞来源的CECs以开发高效分化与移植方案。 方法：从Tie2-GFP小鼠分离皮肤成纤维细胞，通过转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒转导重编程为两条独立的诱导多能干细胞（iPSC）系。采用与RF6A CEC细胞系或原代小鼠CECs共培养的方法，将Tie2-GFP iPSCs分化为CECs。通过RT-PCR和免疫细胞化学检测内皮细胞及CEC特异性标志物对诱导多能干细胞来源的CECs进行鉴定。 结果：在Tie2内皮细胞启动子调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠所生成的诱导多能干细胞呈现经典多能性标志物及干细胞形态。诱导多能干细胞来源的CECs表达碳酸酐酶IV、eNOS、FOXA2、PLVAP、CD31、CD34、ICAM-1、Tie2、TTR、VE-钙黏蛋白和vWF。 结论：诱导多能干细胞来源的CECs将成为模拟AMD中脉络膜毛细血管特异性损伤及未来脉络膜内皮细胞替代疗法的重要工具。
关键词： 脉络膜内皮细胞、诱导多能干细胞、黄斑变性
更新于2025-09-23 15:21:01
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利用SYN1和CaMKII启动子表达的通道视紫红质-2对二维和三维培养体系中iPS细胞来源神经元的光遗传学控制
摘要： 在三维（3D）环境中开发光遗传学可控的人类神经网络模型，可提供一个与生理相关或模拟人脑的研究系统。通过慢病毒和细胞类型特异性启动子，将通道视紫红质-2（ChR2）转导至人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的神经祖细胞（Axol），从而生成光敏神经元。经神经分化后，获得由人iPSCs来源的皮层神经元、星形胶质细胞和祖细胞组成的混合群体（Axol-ChR2）。利用泛神经元启动子突触蛋白-1（SYN1）和兴奋性神经元特异性启动子钙调蛋白激酶II（CaMKII）驱动报告基因表达，以评估靶细胞的分化状态。采用流式细胞术和免疫荧光染色评估分化后Axol-ChR2细胞中ChR2的表达及各亚群特征。将这些细胞从二维培养转移至经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）和小分子（Y-27632）功能化的三维海藻酸盐水凝胶中。对改良的RGD-海藻酸盐水凝胶进行物理特性表征及细胞活性评估，以建立适用于hPSCs和神经细胞的通用3D培养体系。在细胞包封前，采用钙成像技术研究Axol-ChR2细胞和原代神经元的神经网络活动。结果表明，通过CaMKII和SYN1启动子表达ChR2均成功实现了功能性活动。该RGD-海藻酸盐水凝胶体系支持分化后Axol-ChR2细胞的生长，同时在光刺激下可检测到ChR2表达，从而实现对三维人类神经网络的精准无创调控。
关键词： 通道视紫红质-2（ChR2）、光遗传学、诱导多能干细胞（iPSC）、三维培养、钙调蛋白激酶II（CaMKII）、突触素-1（SYN1）、海藻酸盐水凝胶、神经组织工程
更新于2025-09-23 15:19:57
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一种用于运输视网膜色素上皮细胞片的简易静态保存系统
摘要： 将细胞和组织从实验室推向临床是再生医学的关键环节。本研究提出一种简易的静态运输系统用于递送组织工程化细胞片层。该系统无需电子设备且流程简化，最大限度减少了包装与开启步骤。通过优化运输条件，并采用人iPS细胞来源或胎儿视网膜色素上皮（RPE）细胞片层进行系统应用验证。隔热容器内各舱室温度在不同条件下保持稳定，用培养基填满细胞容器能有效防止湍流导致的RPE细胞片层机械损伤。经火车和汽车运输后，RPE形态、跨上皮电阻及mRNA表达均未出现异常变化。这种简易运输系统能降低组织"从实验室到病床"转移过程中的成本与人为失误。本专为再生组织运输设计的系统经验证可直接使用，无需特殊培训。本研究提供了工程化组织便捷共享的操作流程，旨在促进实验室与医院协作并提升患者诊疗水平。
关键词： 运输、诱导多能干细胞、产品包装、视网膜色素上皮、人类、再生医学、温度
更新于2025-09-23 01:11:17
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细胞移植治疗视网膜退行性疾病产生视觉益处的机制
摘要： 研究人员已在动物身上开展视网膜细胞移植研究，以验证其治疗致盲疾病的潜在价值。在孟德尔遗传性视网膜变性动物模型中，研究者移植了光感受器前体细胞；而在年龄相关性黄斑变性（AMD）动物模型及近期患者临床试验中，则采用视网膜色素上皮细胞来恢复视觉功能。相较于矫正性基因疗法，细胞疗法在治疗遗传性视网膜变性时具有优势——通过提供适用于所有遗传亚型的统一治疗方案，可克服遗传异质性问题。对于AMD而言，由于存在多种风险等位基因，矫正性基因疗法从理论上即被排除。从作用机制看，光感受器前体细胞移植实验揭示了移植物与宿主细胞间胞质物质交换对功能修复的重要性，这一意外发现构成了全新理论概念。关于视网膜色素上皮细胞移植，其治疗获益背后的机制尚未完全阐明，相关临床试验仍在进行中。本文综述了描述移植物制备技术开发及视觉功能改善实证的突破性研究。
关键词： 色素性视网膜炎、光感受器、视网膜色素上皮、年龄相关性黄斑变性、细胞质物质转移、诱导多能干细胞
更新于2025-09-23 01:31:14
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双光子聚合技术：研究3D打印拓扑结构诱导干细胞命运的工具
摘要： 已知几何拓扑结构会影响细胞向特定表型的分化，但迄今为止，可用于研究这些相互作用的特征范围及易于制备的基底类型仍较为有限。本研究采用新兴的双光子聚合技术，通过打印不同特征尺寸的拓扑图案来探究其对细胞分化的影响。该技术能快速制造出特征分辨率良好（适用于小于3微米的形状）的拓扑表面。人诱导多能干细胞附着于这些基底或无图案对照基底一周后，会表达一系列遗传标记物，表明其正向来自所有三个胚层的多能祖细胞异质群体分化。与拓扑光滑对照相比，小尺寸特征（1.6微米）促进外胚层分化，而大尺寸特征（8微米）则抑制自我更新。本研究表明双光子聚合技术具有通过调控基底相互作用来研究和控制干细胞命运的潜力。通过这种方式定制和战略性设计生物材料，可实现体外和体内更精准高效地生成或维持目标表型。
关键词： 诱导多能干细胞、分化、基底形貌、3D打印、双光子聚合
更新于2025-09-10 09:29:36
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倡导使用3D干细胞培养系统促进再生医学发展：重点关注光感受器生成
摘要： 干细胞的可获取性为研究早期发育阶段及生成足量细胞用于细胞移植治疗带来了巨大前景。尽管许多干细胞研究者成功解析了内在与外在机制并培育出特定细胞表型，但能实现组织修复的干细胞或分化细胞仍寥寥无几。近年来细胞与干细胞培养技术的进步，在生成可移植后整合组织的真正分化细胞方面取得重大突破，为发育生物学研究和再生医学开辟了新视野。 本综述聚焦于模拟中枢神经系统结构（如神经管及其在不同脑区包括视杯中的发育）自然环境的主要体外研究工作。采用三维类器官细胞培养方案是制备类内源性细胞的关键策略。重点阐述视网膜组织与感光细胞生成案例以突显该领域的发展潜力，同时讨论其他实例如皮层组织、肠上皮或肾脏类器官的形成。从胚胎干细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPSCs）生成分化组织与明确表型细胞，为生物学和再生医学领域开辟了多种新策略。源自人类细胞的体外三维器官/组织发育，为研究人体细胞生物学及器官/特定细胞群体的病理生理学提供了独特工具。本文亦探讨了组织修复前景及建立细胞库以加速该前沿领域发展的必要性。
关键词： 移植、中枢神经系统发育、肾脏、视网膜、大脑皮层、大脑区域化、个性化医疗、肠道、诱导多能干细胞
更新于2025-09-04 15:30:14