研究目的
开发基于光笼醌甲基化物(PQM)的交联剂,用于蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA复合物的光控化学交联,通过特异性迈克尔加成实现对九种亲核残基的多重靶向。
研究成果
光笼醌甲基化物(PQM)交联剂能够实现包括谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)和天冬酰胺(Asn)在内的九种亲核氨基酸残基的交联——这些残基此前无法被靶向。这类交联剂具有光控特性,可实现时空分辨率控制,并已成功应用于体外实验、大肠杆菌、哺乳动物细胞及蛋白质-DNA交联研究。该技术显著拓展了化学交联技术在研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA网络以及结构生物学领域的应用能力。
研究不足
NHQM无法有效进入大肠杆菌细胞进行胞内交联。在哺乳动物细胞中的交联效率较低(<10%)。未来提高PQM交联剂水溶性的努力可能会增强交联效率。
1:实验设计与方法选择:
设计异源及同源双功能光笼醌甲基化物(PQM)交联剂,用于探测蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA复合物。
2:样本选择与数据来源:
采用同源二聚体真核调控蛋白14-3-3、硫氧还蛋白(Trx)及单链DNA结合蛋白(SSB)与DNA寡核苷酸复合物。
3:硫氧还蛋白(Trx)及单链DNA结合蛋白(SSB)与DNA寡核苷酸复合物。
实验设备与材料清单:
3. 实验设备与材料清单:使用NHQM和HoQM交联剂,通过紫外光照激活,采用SDS-PAGE、Western印迹及串联质谱进行分析。
4:实验流程与操作步骤:
将蛋白质与交联剂孵育后进行紫外激活,通过SDS-PAGE、Western印迹及质谱分析交联产物。
5:数据分析方法:
利用串联质谱鉴定交联肽段,测量交联残基间的Ca-Ca距离。
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