研究目的
改进双色荧光原位杂交（FISH）方案，用于检测斑马鱼胚胎中弱表达转录本，并监测反应过程中的信号强度和背景水平。
研究成果
改进的荧光原位杂交（FISH）方案通过使用高灵敏度的AP底物，能够检测两个基因转录本的分布和重叠情况，显著提升了对弱表达或表达变异基因的可视化效果。
研究不足
该协议虽然提高了对弱表达转录本的检测能力并能够监测反应进程，但仍可能需要针对不同模式生物和探针组合进行优化。
1：实验设计与方法选择
该方案采用硝基蓝四氮唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和Vector Red底物进行双色荧光原位杂交(FISH)，结合了碱性磷酸酶长反应时间优势、两种显色反应的实时监测能力以及高分辨率荧光成像特性。
2：样本选择与数据来源
使用20体节期斑马鱼胚胎，经4%多聚甲醛(PFA)固定后，通过乙醇梯度系列脱水，储存于-20°C环境。
3：实验设备与材料清单
抗DIG-AP和抗FL-AP抗体（罗氏诊断）、Vector Red底物（Vector Labs公司）、配备Apo LWD 40×/1.15数值孔径物镜的尼康A1R si STORM倒置显微镜。
4：实验流程与操作步骤
胚胎依次经过复水、清洗、预杂交缓冲液孵育、探针杂交、二次清洗、抗体孵育、底物显色后，采用共聚焦显微镜成像。
5：数据分析方法
获取共聚焦图像并分析转录本的表达模式。
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获取完整内容-
Nikon A1R si STORM inverted microscope
A1R si STORM
Nikon Instruments Inc.
High-resolution fluorescent imaging of zebrafish embryos.
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Vector Red substrate
Vector Labs
Chromogenic substrate for fluorescent in situ hybridization.
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Anti-DIG-AP
Roche Diagnostics
Detection of DIG-labeled probes in in situ hybridization.
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Anti-FL-AP
Roche Diagnostics
Detection of FL-labeled probes in in situ hybridization.
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