研究目的
开发并描述一种基于荧光的增殖检测方法，用于在亚细胞水平上准确识别宿主细胞内复制的细菌，以金黄色葡萄球菌和巨噬细胞为模型，并证明其与额外细胞探针的兼容性以及对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的适用性。
研究成果
基于荧光的增殖检测法能有效识别宿主细胞内的复制细菌，且兼容其他细胞探针用于微环境特征分析。该方法适用于革兰氏阳性菌和阴性菌，为研究宿主-病原体相互作用提供了有价值的工具，但需谨慎优化且仅限于显微分析。
研究不足
该检测方法最适合荧光显微镜观察，而非流式细胞术，因为单个细胞内吞噬体内容物存在异质性。针对不同细菌种类和菌株需进行优化，使用LysotrackerTM等探针时需谨慎以避免固定假象。
1：实验设计与方法选择：
该检测基于使用荧光增殖染料（eFluorTM-670）标记细菌，该染料在细菌复制时稀释，从而区分复制与非复制细菌。实验包括用标记细菌感染巨噬细胞，随后通过荧光显微镜检测染料稀释情况。
2：样本选择与数据来源：
细菌菌株包括金黄色葡萄球菌USA300、假结核耶尔森菌、鼠伤寒沙门氏菌和 大肠杆菌。巨噬细胞类型包括永生化细胞系（如RAW 264.7）、原代小鼠骨髓源性巨噬细胞和原代人巨噬细胞。
3：假结核耶尔森菌、鼠伤寒沙门氏菌和 大肠杆菌。巨噬细胞类型包括永生化细胞系（如RAW 7）、原代小鼠骨髓源性巨噬细胞和原代人巨噬细胞。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：荧光增殖染料（eBioscienceTM细胞增殖染料eFluorTM 670）、GFP表达载体、组织培养板、盖玻片、显微镜（如Leica DMI6000 B）以及各种细胞培养和染色试剂。
4：0）、GFP表达载体、组织培养板、盖玻片、显微镜（如Leica DMI6000 B）以及各种细胞培养和染色试剂。 实验步骤与操作流程：
4. 实验步骤与操作流程：用eFluorTM-670标记细菌，以特定MOI感染巨噬细胞，孵育后通过荧光显微镜分析。额外使用如LysotrackerTM和LAMP-1免疫荧光染色进行亚细胞特征分析。
5：数据分析方法：
使用Leica LAS X和FIJI等软件获取并处理图像，通过荧光强度测量和背景扣除来识别复制细菌。
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获取完整内容-
Cell Proliferation Dye eFluor 670
65-0840-85
Thermo Fisher Scientific
Fluorescent labeling of bacteria to track replication by dilution of the dye in daughter cells.
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Leica DMI6000 B Microscope
DMI6000 B
Leica
Wide-field fluorescence microscopy for imaging labeled bacteria and cells.
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Lysotracker Red DND-99
Not specified
Thermo Fisher Scientific
Staining acidic compartments like phagolysosomes in live cells.
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Wheat Germ Agglutinin conjugated to Tetramethylrhodamine
Not specified
Not specified
Labeling cell membranes and extracellular bacteria.
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Anti-LAMP-1 Antibody
Clones 1D4B (mouse) and H4A3 (human)
Developmental Studies Hybridoma Bank
Immunostaining to detect lysosome-associated membrane protein-1.
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Cy3-conjugated Secondary Antibody
Not specified
Jackson Immunoresearch
Detecting primary antibodies in immunofluorescence.
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