研究目的
描述一种使用CM-H2DCFDA检测秀丽隐杆线虫活性氧（ROS）水平以评估线粒体功能完整性的方法。
研究成果
该协议提供了一种可靠的方法，利用CM-H2DCFDA检测秀丽隐杆线虫体内的活性氧（ROS）水平，有助于评估线粒体健康状况和氧化应激情况，在研究神经退行性疾病方面具有应用价值。
研究不足
用于活性氧测量的蠕虫裂解液不能冷冻保存以备后用。该方案可能会因活体动物的自发荧光而受到干扰，但使用裂解液可避免此问题。FUDR处理可能影响线粒体功能，且不应使用饥饿的动物。
1：实验设计与方法选择：
本方案采用CM-H2DCFDA（一种细胞可渗透的还原型荧光素氯甲基衍生物），该物质被活性氧簇氧化后会产生荧光信号。为避免活体成像中的自发荧光干扰，选择使用线虫裂解液进行检测。
2：样本选择与数据来源：
秀丽隐杆线虫菌株购自线虫遗传学中心(CGC)，在以大肠杆菌OP50为食源的NGM培养基上培养。通过饥饿法同步化L1期幼虫，培育至1日龄成虫进行分析。
3：实验仪器与材料清单：
包括培养皿、离心管、移液器、超声波破碎仪、离心机、高压灭菌器、显微镜、酶标仪及CM-H2DCFDA、BCA蛋白定量试剂盒、M9和PBS缓冲液等试剂。
4：实验流程与操作步骤：
包含线虫培养同步化、通过冷冻-超声破碎-离心制备线虫裂解液、与CM-H2DCFDA染料孵育、酶标仪检测荧光强度等环节，数据分析经标准化处理和统计学检验。
5：数据分析方法：
在485nm激发光/535nm发射光波长下测定荧光强度，数据经无虫对照组扣除及野生型标准化处理后，使用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析及Bonferroni事后检验。
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Conical tubes
430829, 430791
Corning
Used for sample storage and centrifugation.
-
Chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate
C6827
Thermo Fisher Scientific, Invitrogen?
Dye used to measure ROS levels by fluorescence.
-
Microscope
SteREO Discovery.V8
ZEISS
Used for observing nematodes.
-
Petri dishes
2900, 2901
Kord-Valmark Labware Products
Used for growing C. elegans on NGM plates.
-
Centrifuge tubes
6285
Globe Scientific
Used for holding and centrifuging samples.
-
Coverslip
1404-10
Globe Scientific
Used in microscopy.
-
Pasteur pipettes
6-72050-900
Krackeler Scientific
Used for transferring liquids.
-
Vacuum filtration
6722-5001
GE Healthcare, Whatman
Used for sterilizing solutions.
-
Micro Centrifuge tube
229443
CELLTREAT Scientific
Used for small volume samples.
-
C. elegans strains and OP50
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Biological samples used in the experiment.
-
BCA protein assay
23227
Pierce, Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific?
Used to measure protein concentration in lysates.
-
Polybead Polystyrene microspheres
00876-15
Polysciences
Possibly used as standards or in procedures (not specified in detail).
-
Agarose
A20090-500.0
RPI
Used in media preparation.
-
Single channel pipettes
PR-10, PR-20, PR-200, PR-1000
Rainin
Used for precise liquid handling.
-
Multichannel pipettes
Fisherbrand? Finnpipette? II, 21377830
Fisher Scientific
Used for high-throughput liquid handling.
-
Sonic Dismembrator
Sonic Dismembrator Model 100
Fisher Scientific
Used to sonicate worm samples for lysate preparation.
-
Centrifuge
IEC Centra CL2
Thermo Fischer Scientific, Thermo Scientific?
Used for centrifuging samples.
-
Centrifuge
5415 D
Eppendorf
Used for centrifuging small samples.
-
Autoclave
433/533HC-E
Getinge, Castle Steam Sterilizer
Used for sterilizing equipment and media.
-
Microplate Reader
FlexStation? 3
Molecular Devices
Used to measure fluorescence intensity.
-
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