研究目的
开发一种利用CRISPR/Cas9技术在秀丽隐杆线虫中生成内源性荧光报告基因的高效方法，以克服插入大DNA片段所面临的挑战。
研究成果
嵌套CRISPR是一种高效、无需克隆的方法，可在秀丽隐杆线虫中生成内源性荧光报告基因，在多个位点均具有高成功率。该方法具备可靠性、?？榛涂衫┱剐?，但编辑效率存在差异，对大片段和必需基因仍需进一步优化。该技术能实现精准基因组编辑，且在其他生物体中具有潜在应用价值。
研究不足
步骤2的效率因染色质结构等因素而异；较大插入片段（如927 bp片段）的效率较低；某些情况下需要纯合菌株，这对必需基因具有挑战性；依赖商业试剂和特定设备；潜在脱靶效应尚未完全解决。
1：实验设计与方法选择：
嵌套CRISPR法包含两步流程。第一步利用单链DNA供体通过同源定向修复将荧光蛋白（EGFP、mCherry、wrmScarlet）的5'和3'片段插入目标位点；第二步使用通用crRNA和PCR产物插入中间片段以完成荧光蛋白序列。采用与dpy-10的共CRISPR策略进行富集筛选。
2：样本选择与数据来源：
以秀丽隐杆线虫Bristol N2品系为野生型背景，靶向基因包括prpf-4、gtbp-1、pgl-1、ubh-4、sftb-1、nfki-1、K12C11.3和F27C1.2。
3：gtbp-pgl-ubh-sftb-nfki-K12C3和F27C2。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：包含crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白、单链寡核苷酸（ssODN）、PCR产物、显微注射设备（Eppendorf Femtotips、XenoWorks显微注射系统、尼康Eclipse Ti-S显微镜）、琼脂垫、NGM培养板、大肠杆菌OP50、高保真Phusion DNA聚合酶、MinElute PCR纯化试剂盒、QIAquick PCR纯化试剂盒。
4：高保真Phusion DNA聚合酶、MinElute PCR纯化试剂盒、QIAquick PCR纯化试剂盒。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：将RNP复合物显微注射至线虫性腺，线虫恢复饲养，筛选dpy-10编辑个体，PCR基因分型，荧光显微镜可视化筛选，Sanger测序验证。
5：数据分析方法：
以筛选线虫中阳性编辑比例为效率计算依据，基于PCR和荧光数据进行统计分析。
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Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
F530S
Thermo Fisher Scientific
PCR amplification of DNA fragments
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crRNA
2 nmol products
IDT
Guide sequences for Cas9 targeting in CRISPR genome editing
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tracrRNA
1072532
IDT
Forms RNA duplex with crRNA for Cas9 guidance
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Cas9
1081058
IDT
Nuclease for introducing double-strand breaks in DNA
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ssODN
4 nmol ultramers
IDT
Single-stranded DNA donors for homology-directed repair
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MinElute PCR purification kit
28004
QIAGEN
Purification of PCR products
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QIAquick PCR purification kit
28104
QIAGEN
Purification of PCR products for sequencing
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Eppendorf Femtotips Microinjection Capillary Tips
930000035
Eppendorf
Capillary tips for microinjection
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Eppendorf Microloader Pipette Tips
5242956003
Eppendorf
Loading injection mixes into capillaries
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XenoWorks Microinjection System
Sutter Instrument
System for microinjection into C. elegans
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Nikon Eclipse Ti-S inverted microscope
Nikon
Microscopy for injection and fluorescence screening
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