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《分子生物学方法》自噬卷1880（方法与实验方案）|| 利用关联光镜与电镜技术分析秀丽隐杆线虫胚胎中的LC3蛋白
摘要： 在本章中，我们介绍了一种对秀丽隐杆线虫胚胎进行关联光镜与电镜（CLEM）研究的实验方案。该方法采用特殊固定技术，既能保持GFP荧光信号，又能维持样本的结构完整性。首先通过光学显微镜分析薄切片以检测GFP标记蛋白，再利用透射电子显微镜（TEM）解析细胞的超微结构解剖特征。光镜与电镜图像的叠加可确定荧光蛋白的亚细胞定位。我们运用此方法研究了自噬在线虫胚胎凋亡细胞吞噬过程中的作用，分析了凋亡细胞与吞噬细胞中LC3/GABARAP蛋白的两个同源物——LGG-1和LGG-2的定位情况。
关键词： LC3相关吞噬作用、高压冷冻、冷冻替代、LGG-2、绿色荧光蛋白、GMA树脂、LGG-1
更新于2025-09-23 15:22:29
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侧链扭转决定了绿色荧光蛋白发色团的平面性和可电离性，从而导致光谱扰动。
摘要： 荧光蛋白（FP）的光谱特性已被深入研究，通过蛋白质工程已构建出覆盖整个可见光谱的多种FP变体。导致FP光谱偏移的最常见机制包括激发态质子转移（ESPT）、羟基部分的质子化与去质子化以及发色团顺反异构。研究最广泛的FP源自维多利亚水母绿色荧光蛋白（avGFP）和珊瑚虫红色荧光蛋白（DsRed）。除上述机制外，某些相互作用残基被认为对改变质子转移路径起关键作用。通过研究野生型avGFP、S65T突变体avGFP及DsRed的扭转变化发现，DsRed的范德华堆积比avGFP更紧密，从而形成低溶剂可占据环境并减少溶剂相互作用，这解释了其红移光谱特性。我们推测扭转构象景观和改变的残基相互作用是光谱偏移的重要因素。通过200纳秒分子动力学模拟预测，这些因素共同导致了众多光谱变体的产生。同样，氢键网络本身并不能完全决定FP的能量景观，非键相互作用也能通过偶极-偶极诱导产生次级谐波偏移。侧链接触会改变拓扑结构和扭转几何形态，从而破坏发色团的平面性。侧链扭转变异对FP畸变的影响几乎未被探究。我们解析了残基间接触距离和几何描述符。
关键词： 绿色荧光蛋白、光谱扰动、侧链扭转变化、残基可及面积、发色团平面性
更新于2025-09-23 15:21:01
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SLIM显微镜技术可用于观察专为牛精子介导基因转移设计的含DNA脂质体
摘要： 裸露的DNA已被证实能自然结合精子，这种方法称为精子介导的基因转移（SMGT）?；谡庑┕鄄?，我们利用脂质体研究了外源DNA与精子结合的效率。本实验中，我们分析了冷冻解冻牛精子的筛选方法，并评估了外源DNA与这些精子的结合情况。为确定最佳筛选方法，我们采用计算机辅助精液分析（CASA）。分别使用Percoll或上游法筛选精子后，与脂质体-DNA复合物共孵育长达3小时。分别在1小时和3小时后收集样本。我们以增强型绿色荧光蛋白（eGFP）结合脂质体作为外源DNA结合的标记物。每种筛选方法设置五个处理组：(1)无孵育、无脂质体和无DNA；(2)仅孵育、无脂质体和无DNA；(3)孵育含脂质体但无DNA；(4)孵育含脂质体和1μg DNA；(5)孵育含脂质体和10μg DNA。CASA检测显示，Percoll组对照组与其他处理组在总活力和快速运动力方面存在统计学显著差异（P<0.01），而上游法则无此现象，因此选择上游法作为最佳筛选方法。为确认脂质体-DNA复合物是否结合精子，采用实时PCR检测GFP DNA，并通过空间光干涉显微镜（SLIM）分析精子图像。SLIM证实精子头部和尾部存在脂质体。
关键词： 绿色荧光蛋白、精子、脂质体、SLIM、显微镜技术、精子介导的基因转移
更新于2025-09-23 15:19:57
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蛋白质发色团的阴离子光电子能谱
摘要： 自然界中广泛存在着能高效且选择性地将光能转化为物理响应的光活性蛋白质。这些过程的核心小分子发色团通常在质子转移反应脱质子后以闭壳层阴离子形式存在。本综述重点介绍了阴离子光电子能谱结合计算化学计算在提升我们对这些蛋白质发色团电子结构及弛豫动力学认知方面的重要作用。我们首先讨论阴离子光电子能谱的关键要点，随后回顾近期针对绿色荧光蛋白（GFP）、光敏黄色蛋白（PYP）中脱质子发色团阴离子以及荧光素酶中脱质子荧光素阴离子开展的阴离子光电子能谱研究。
关键词： 电喷雾电离、阴离子光电子能谱、光敏黄色蛋白、荧光素、绿色荧光蛋白、光致解吸
更新于2025-09-22 14:04:14
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生成具有RFP和GFP标记血小板两大群体的转基因斑马鱼：分析其脂质
摘要： 斑马鱼血小板与哺乳动物血小板相似。哺乳动物存在年轻血小板（又称网织血小板）和成熟血小板，斑马鱼同样具有两类血小板群体：DiI-C18（DiI）阳性（DP）与阴性（DN）。然而DiI选择性标记血小板的机制尚不明确，且目前缺乏能分别用荧光蛋白差异标记DP与DN血小板的转基因斑马鱼品系。本研究中发现，由肌球蛋白轻链2启动子驱动红色荧光蛋白（RFP）基因的Glo鱼存在RFP标记的血小板群体。我们进一步构建了转基因GloFli鱼品系，实现DP与DN血小板分别被RFP和绿色荧光蛋白（GFP）标记。单细胞脂质分析显示，相比GFP+血小板，RFP+血小板中磷脂酰乙醇胺（PE）含量增加两倍而磷脂酰胆碱（PC）减少两倍，提示脂质组成可能影响DiI的差异标记。通过测试不同PC/PE比例脂质体发现：高PE含量脂质体更易被DiI标记，而PC浓度影响较弱；纯PE或PC脂质体中，PE浓度升高会增强DiI结合。这些结果表明，由于RFP+血小板具有更高PE浓度，DiI能高效结合从而实现选择性标记。本研究提供的GloFli鱼品系将有助于阐明血小板成熟机制。
关键词： 脂质组成、红色荧光蛋白、磷脂酰胆碱、绿色荧光蛋白、DiI（1,1'-二二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）、磷脂酰乙醇胺、血小板、斑马鱼
更新于2025-09-19 17:13:59
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利用绿色荧光蛋白检测内膜蛋白OppC的可溶性表达及体内相互作用
摘要： 本研究分析了寡肽通透酶（Opp）蛋白的体内相互作用系统，通过灵活运用绿色荧光蛋白（GFP）构建了内膜蛋白OppC的高表达系统。将编码寡肽转运体跨膜组分的大肠杆菌OppC基因克隆至不同载体，转化至不同大肠杆菌菌株并优化表达条件，通过凝胶内分析和Western印迹评估质粒与表达菌株对OppC产量的影响。携带GFP报告基因的pWaldo-GFPe载体转化E. coli C43(DE3)后产生的OppC，为生化和生物物理研究提供了足量功能性蛋白。采用GFP片段重组法检测到寡肽通透酶蛋白间的体内相互作用：底物结合蛋白OppA与其他组分无相互作用，ATP结合组分OppD不与OppF互作；而OppD和OppF均与跨膜组分OppB、OppC相互作用，OppB还直接与OppC结合。通过构建OppC基因缺失株确定其体内功能——对肽段摄取至关重要但对细胞存活非必需。这些结果有助于阐明细菌的寡肽转运机制。
关键词： 寡肽通透酶，蛋白质 - 蛋白质相互作用，内膜蛋白，绿色荧光蛋白
更新于2025-09-10 09:29:36
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基于荧光团相变方法对活细胞中小分子诱导的蛋白质-蛋白质相互作用进行动态成像
摘要： 蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）介导细胞内的信号转导。调控PPIs的小分子是生物学和生物医学研究的重要工具。通过动态成像技术观察小分子诱导的PPIs，可在活细胞中表征并验证这些分子。因此，开发能动态可视化活细胞中小分子诱导蛋白质结合与解离的细胞检测方法至关重要。本研究基于荧光团相变原理，设计了一种名为SPPIER（基于相分离的蛋白相互作用报告系统）的PPI检测体系。该系统利用绿色荧光蛋白（GFP）实现遗传编码，在小分子诱导PPI时，能在活细胞中快速形成高荧光强度的GFP液滴。SPPIER可检测免疫调节药物（IMiDs）诱导的cereblon与转录因子Ikaros之间的PPI，也能识别IMiDs类似物（如CC-885）诱导的cereblon与GSPT1结合。该系统经改造后还可用于监测小分子诱导的蛋白质解离过程，例如nutlin引起的HDM2与p53解离。SPPIER具有高亮度和快速动力学特性，能实现对活细胞中PPIs的稳健动态可视化。
关键词： 绿色荧光蛋白、小分子、SPPIER、活细胞、荧光团相变、蛋白质-蛋白质相互作用
更新于2025-09-10 09:29:36
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以多种绿色荧光蛋白作为化学交联供体，用于育空橙色荧光蛋白的福斯特共振能量转移：一项基于项目的本科实验教学体验
摘要： 福斯特共振能量转移（FRET）是生物医学研究中众多技术的基础。由于其在分子传感中的广泛应用，FRET常被纳入生物学、化学和物理学课程。尽管FRET在生物物理科学中具有重要意义，但构建FRET实验的复杂性和难度导致其在本科实验室环境中的应用有限。在此，我们介绍一个实用的本科实验室实验，通过使用多种绿色发射荧光蛋白（FPs）作为供体，与交联的育空橙色FP进行能量转移来教授FRET。该实验使学生能够将基础实验操作与实际应用联系起来，适用于分子生物学、生物化学、物理化学和生物物理实验室课程。
关键词： 高年级本科生，橙色荧光蛋白，荧光寿命，蛋白质，绿色荧光蛋白，生物化学，时间相关单光子计数，荧光光谱学
更新于2025-09-10 09:29:36
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《分子生物学与转化科学进展》第160卷 || 荧光蛋白作为小鼠细胞行为的传感器
摘要： 在小鼠体内表达荧光蛋白的癌细胞成像技术，可实时追踪癌症生长与转移过程，并评估候选抗肿瘤及抗转移药物的疗效，尤其在原位小鼠模型中效果显著。通过用不同荧光蛋白分别标记细胞核与细胞质中的癌细胞，能够活体观察癌细胞的核质动态变化，包括有丝分裂、细胞凋亡、细胞周期阶段，以及癌细胞变形、迁移和外渗过程中核质呈现的差异行为。该技术的最新应用包括将荧光蛋白与细胞周期特异性蛋白偶联，使细胞在从G1期进入S期时由红色转变为绿色。借助荧光蛋白可对任何活体过程进行成像，推动分子生物学研究从体外实验迈向活体动物分子过程研究。
关键词： 癌症成像、转移、红色荧光蛋白、体内成像、绿色荧光蛋白、荧光蛋白
更新于2025-09-10 09:29:36
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时代变迁：淀粉样生成性SF-IAPP融合蛋白的荧光寿命分析
摘要： 在多种构象疾病中，会出现携带非天然构象的蛋白质在细胞内积聚的现象。寻找能够阻碍有毒蛋白质聚集体和纤维形成的化合物是一项紧迫任务。现有的纤维检测荧光方法难以实现简单的实时观测。我们拟采用目标蛋白与绿色荧光蛋白融合技术及荧光寿命测量法来实现这一目的。所分析的重组蛋白由大肠杆菌生产，通过质谱技术鉴定其一级结构及翻译后修饰。利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）研究了超折叠绿色荧光蛋白（SF）与胰岛淀粉样多肽融合蛋白（SF-IAPP）在聚丙烯酰胺凝胶中的荧光寿命。结果表明，在此条件下凝胶中SF的平均荧光寿命与SF-IAPP单体略有差异。SF-IAPP未丧失形成类淀粉样纤维的能力。相同条件下（聚丙烯酰胺凝胶中），SF与SF-IAPP单体的荧光时间特征相似，而SF-IAPP在纤维状态下的平均荧光寿命显著降低。我们建议在构象疾病细胞模型研究中，应用FLIM技术测量融合蛋白（致淀粉样变蛋白-SF）的平均荧光寿命。
关键词： FLIM（荧光寿命成像显微镜）、IAPP（胰岛淀粉样多肽）、类淀粉样纤维、绿色荧光蛋白、原子力显微镜、构象疾病
更新于2025-09-09 09:28:46