研究目的
分析寡肽通透酶（Opp）蛋白的体内相互作用系统，并利用绿色荧光蛋白（GFP）构建内膜蛋白OppC的高表达系统。
研究成果
该研究成功利用绿色荧光蛋白（GFP）构建了内膜蛋白OppC的高表达系统，优化了表达与纯化方案，并检测了寡肽通透酶蛋白间的体内相互作用。结果表明OppC对肽段摄取至关重要但对细胞存活非必需。这些发现有助于理解细菌的寡肽转运机制，或为开发抗多重耐药病原菌的新型药物提供帮助。
研究不足
该研究的局限性在于无法为所有膜蛋白（尤其是固有稳定性较低的内膜蛋白）获取纯且足量的功能性蛋白。从聚集的包涵体中复性膜蛋白是一项挑战。
1：实验设计与方法选择：
研究将大肠杆菌OppC基因克隆至不同载体，转化重组质粒至不同大肠杆菌菌株，并优化表达条件。通过凝胶内分析和Western印迹评估质粒与表达菌株对OppC产量的影响。
2：样本选择与数据来源：
以大肠杆菌k-12基因组DNA为模板克隆OppC，采用多种大肠杆菌菌株进行基因克隆与蛋白表达。
3：实验设备与材料清单：
使用pACYC-duet1、pET28及衍生载体pWaldo-GFPe作为基因克隆与表达载体，KOD-Fx聚合酶与限制性内切酶用于PCR和酶切。
4：pET28及衍生载体pWaldo-GFPe作为基因克隆与表达载体，KOD-Fx聚合酶与限制性内切酶用于PCR和酶切。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：通过标准PCR扩增OppC编码序列，连接至表达载体并转化大肠杆菌菌株。IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE与Western印迹分析表达产物。
5：数据分析方法：
采用凝胶内荧光、Western印迹及GFP片段重组方案分析蛋白表达与相互作用。
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获取完整内容-
KOD-Fx polymerase
ToYoBo
Used for standard PCR to amplify the OppC encoding sequence.
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restriction enzymes
Fermentas
Used for digestion of PCR products and vectors.
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pWaldo-GFPe
Used as an expression vector for OppC, harboring the GFP reporter gene.
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Ni-NTA affinity resin
Qiagen
Used for enriching the protein from the cell lysate.
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HiPrep 26/10 Desalting column
GE Healthcare
Used for desalting the eluted protein.
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HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column
GE Healthcare
Used for further purification of the protein by size-exclusion chromatography.
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iBlot? Dry Blotting System
Invitrogen
Used for electro-blotting the protein onto a nitrocellulose membrane.
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MicroPulser
Bio-Rad
Used for electroporation of the cells.
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