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基于绿色荧光蛋白的葡萄糖指示剂可报告活细胞中的葡萄糖动态变化
摘要： 葡萄糖是生物体最重要的能量来源。本研究开发了一系列基于单荧光蛋白（FP）的葡萄糖指示剂，命名为"绿色Glifons"，用于解析能量代谢相关分子间的层级与互作关系。三种指示剂对葡萄糖表现出不同的EC50值（50微米、600微米和4000微米），响应葡萄糖时产生约7倍的荧光强度变化。这些指示剂可可视化活体HeLa细胞胞质、质膜、细胞核及线粒体中的葡萄糖动态，也能在秀丽隐杆线虫咽肌中实现活体成像，并能检测小鼠血糖水平。最终，该指示剂适用于双色成像，揭示了小鼠胰腺MIN6 m9β细胞中葡萄糖与Ca2+的动态相互作用。我们认为这些指示剂将促进能量代谢的活体多色成像研究。
关键词： 生物传感器、人工甜味剂、双色成像、秀丽隐杆线虫、活细胞成像、葡萄糖、血糖水平、荧光蛋白
更新于2025-11-21 11:24:58
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对香豆酸的波长依赖性光异构化过程是否源于电子态依赖的路径？
摘要： 与阴离子光活性黄蛋白（PYP）发色团类似，其中性形式的发色团也表现出波长依赖性的光异构化量子产率。该异构化量子产率随S1态激发能量的增加而升高，但在激发至S2态时则降低。这种波长依赖的产物产率是否源于S1和S2态的特定反应路径？这意味着S2态的弛豫路径与S1态不同且不涉及扭转运动。它通过展示从S2态直接跃迁至基态是否违背了Kasha规则？其潜在机制尚需进一步探究。本文采用实时动力学模拟与静态电子结构计算揭示了中性PYP发色团的失活机制。结果表明：C-C扭转运动主导了S1态的衰减过程；而S2态衰减过程中则观察到通过平面锥形交叉的超快S2→S1态跃迁，过剩能量激活了以环状褶皱畸变为特征的新型基态反应通道——该路径与光异构化通道形成竞争。未观测到S2→S0的直接跃迁，因此Kasha规则在此过程中成立。我们的计算能合理解释中性PYP发色团波长依赖的异构化量子产率，并为比较质子化状态对PYP发色团动力学行为的影响提供理论基础。
关键词： 波长依赖性、光异构化、荧光蛋白、非绝热过程
更新于2025-09-23 15:23:52
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天然存在的氯离子开启型黄色荧光蛋白传感器的发现与表征
摘要： 荧光蛋白已被广泛改造并应用于多种生物环境中作为氯离子的光学指示剂。令人惊讶的是，尽管荧光蛋白具有丰富的生物多样性，迄今为止尚未报道过天然存在的氯离子传感器。本研究鉴定并光谱表征了来自水母Phialidium属（phiYFP）的黄色荧光蛋白——这是首个天然存在的、激发比率型且具有荧光开启特性的氯离子荧光蛋白传感器。结果表明氯离子结合会调节发色团Y66的pKa值，并使平衡态从荧光型酚盐形式向弱荧光型酚形式转变。后者可能通过激发态质子转移产生pH依赖性的荧光开启响应。此外，阴离子选择性实验和氯离子结合口袋的突变研究为所提出的氯离子传感机制提供了进一步证据?；谡庑┨匦?，我们认为经过进一步改造后，phiYFP有望成为成像细胞氯离子动态变化的新工具。
关键词： phiYFP、诱变、氯离子传感器、阴离子选择性、开启式荧光、pH依赖性、激发比率型、荧光蛋白
更新于2025-09-23 15:21:21
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分子动力学与突变研究揭示外源氨基酸对荧光蛋白发色团生物合成的影响
摘要： 酶活性位点中催化氨基酸与底物的精确定位是生物催化的关键因素。荧光蛋白（FPs）发色团的生物合成是一个必须符合这些要求的自催化过程。我们发现，除发色团邻近的内部氨基酸残基外，发色团生物合成还受β-桶结构外表面远端氨基酸的影响。先前研究表明，来自?？簦╖oanthus sp.）的红色荧光蛋白（zoan2RFP）发色团生物合成需经历未成熟绿色状态，而与该蛋白高度同源的绿色荧光蛋白（zoanGFP）其发色团生物合成的最终阶段即为绿色状态。另有研究显示，zoanGFP发色团形成序列中的单点N66D突变可能触发红色发色团合成，但该情况下红色发色团合成不完全且仅在高温下发生。本研究旨在揭示调控红色发色团生物合成的其他结构决定因素。通过比较zoanGFP与zoan2RFP，发现两者β桶内部存在五处氨基酸差异。对zoanGFP-N66D这五个位点进行饱和突变后，获得与zoan2RFP具有相同β桶内氨基酸组成的zoanGFPmut，该突变体仅在高温下呈现部分绿→红发色团转变。为阐明影响红色发色团生物合成的额外因素，我们对zoan2RFP和zoanGFPmut进行了分子动力学模拟比较，发现若干外部氨基酸可能影响这些蛋白中发色团周围氨基酸残基的排布与柔性。突变实验证实了这些残基对红色发色团生物合成的关键作用。最终获得的zoanGFPmut2表现出完全的绿→红转变，表明β桶表面突变的氨基酸有助于红色发色团生物合成。
关键词： 自催化、发色团、蛋白质工程、荧光蛋白、分子动力学模拟、长程相互作用
更新于2025-09-23 15:19:57
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纳米抗体检测标准荧光蛋白实现高分辨率且位移误差最小的多目标DNA-PAINT技术
摘要： DNA点积累纳米拓扑成像技术（PAINT）是一种快速发展的荧光超分辨率技术，可实现低于10纳米的空间分辨率。该技术还能对同一样本中的多个目标进行成像。然而，利用DNA-PAINT以如此高分辨率观察细胞结构仍具挑战性。常规使用的抗体会导致目标蛋白与报告荧光团之间产生20-25纳米的位移，从而限制了分辨能力。本研究采用纳米抗体将该连接误差最小化至约4纳米。我们通过三种能分别结合不同荧光蛋白家族的纳米抗体，展示了多重成像能力。通过直接且化学计量的化学偶联方法，将纳米抗体与单链DNA结合。此外，我们构建了通用型计算机控制微流控装置，实现了高效的多重DNA-PAINT成像。作为原理验证，我们对线粒体、高尔基体和染色质上的蛋白质进行了标记与成像，在仅35分钟的采集时间内获得了20纳米分辨率的三重目标超分辨图像。
关键词： DNA-PAINT（DNA点积累成像技术）、微流控技术、超分辨率显微镜、荧光蛋白、分子定位、多色成像、多重成像、单结构域抗体（sdAb）、连接误差、纳米抗体
更新于2025-09-22 12:22:15
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通过129Xe核磁共振和荧光光谱法对蛋白质进行双模态检测
摘要： 对生物现象的全面理解需要灵敏且无创的检测手段。本研究报道了一种细胞内蛋白质探针的优化方案，该探针结合了荧光检测与超极化129Xe核磁共振检测的优势。荧光检测部分由六肽残基组成的四半胱氨酸标签（-CCXXCC-）（通过基因工程整合至目标蛋白）和小分子有机探针CrAsH构成——当CrAsH与四半胱氨酸标签结合时即产生荧光。生物传感器的129Xe核磁共振检测部分通过间隔臂与CrAsH基团相连，其核心为完全适配氙气可逆包合的隐色烷结构。我们通过测试三种含四半胱氨酸标签的肽段及四种不同立体构型的有机生物传感器，筛选出最适合体外蛋白质检测的最佳组合。
关键词： 生物传感器、四半胱氨酸标签、荧光、129Xe核磁共振、隐色烷、荧光蛋白
更新于2025-09-22 13:58:56
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类绿色荧光蛋白的拉曼光谱
摘要： 该研究的目的是阐明荧光蛋白发色团结构的光学特性。研究人员测量了多种发射波长（绿、黄、青、红）的常用类绿色荧光蛋白（FPs）的拉曼光谱，包括增强型均质荧光蛋白EGFP、EYFP和ECFP（来自水母）以及mNeptune（来自?？Ｍü馄状槭舴治?，获得了高质量的拉曼光谱并识别出多个FPs发色团的标志性谱带。我们报道了C5=C6拉曼谱带位移与FPs激发能之间存在正线性相关关系，这一结论通过将吸收最大值（cm-1）与EGFP、ECFP、EYFP、阴离子发色团及中性发色团中C5=C6拉曼谱带位置进行对照绘图得以验证。本研究揭示了所观察FPs发色团中的新拉曼特征，有助于更深入理解荧光蛋白的光学性质。
关键词： 发色团、荧光蛋白、拉曼光谱
更新于2025-09-22 14:57:06
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通过嵌套CRISPR技术在秀丽隐杆线虫中高效生成内源性荧光报告基因
摘要： 基于CRISPR的模型生物基因组编辑方法正以惊人速度发展。虽然构建缺失或错义突变体相当直接，但制备内源性荧光报告基因更具挑战性。我们开发了无需克隆的核糖核蛋白驱动技术——嵌套CRISPR（Nested CRISPR），能稳健地在秀丽隐杆线虫中生成携带EGFP、mCherry或wrmScarlet的内源性荧光报告基因。该方法将荧光蛋白（FP）序列分割为三个片段：第一步使用单链DNA供体（≤200 bp）将FP的5'和3'片段插入目标位点；第二步利用这些序列作为同源区域，通过含中间片段的dsDNA供体（PCR产物）进行同源定向修复，从而完成FP序列拼接。嵌套CRISPR的第一步（单链DNA供体操作）是已验证的高效编辑方法，第二步因采用通用crRNA和PCR产物而具有可靠性。我们还应用该技术在非必需基因中分两步操作：先制备缺失突变体，再生成转录报告基因。为优化方法，我们测试了合成sgRNA但未显著提升效率。通过整合所有步骤一和步骤二的试剂进行单次注射，我们在5个测试位点中的3个获得成功，最高编辑效率达20%。最后探讨了该技术的未来应用前景。
关键词： 荧光蛋白、CRISPR、基因组编辑、秀丽隐杆线虫、Cas9
更新于2025-09-23 19:58:45
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通过时间分辨晶体学和瞬态吸收光谱揭示荧光蛋白的光开关机制
摘要： 可逆开关荧光蛋白（RSFPs）是先进荧光成像中的标记物。从非荧光关闭态到荧光开启态的光开关过程涉及生色团的反式-顺式异构化及质子转移。虽然皮秒时间尺度的激发态事件已通过结构表征得以解析，但较慢时间尺度上的构象变化仍不明确。本研究结合X射线自由电子激光的时间分辨串行晶体学与纳秒分辨的泵浦-探测紫外-可见光谱技术，阐明了RSFP rsEGFP2中关闭态到开启态的光开关机制。光激发后十纳秒时，晶体结构显示生色团已完成反式到顺式的异构化，但其周围口袋构象与最终开启态存在差异。光谱分析表明该基态光中间体的生色团处于质子化状态。随后在微秒时间尺度发生的去质子化过程，与邻近保守组氨酸残基的构象变化相关联。结合先前关于激发态的研究数据，我们的发现完整揭示了rsEGFP2中关闭态到开启态光开关的详细机制。
关键词： 时间分辨晶体学、荧光蛋白、瞬态吸收光谱、光开关、rsEGFP2
更新于2025-09-19 17:13:59
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激光开关对比显微镜监测细胞核内自由与受限扩散
摘要： 一种名为激光切换对比显微镜（LSCM）的新型显微技术，可实现对单细胞区室内光开关蛋白动态的成像。我们展示了该技术用于监测光开关荧光蛋白Dreiklang（DRK）单分子扩散特性的应用。在胞质表达DRK的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞细胞核中进行的LSCM观测显示：DRK分子在数秒内即可完成整个细胞质和细胞核内的快速扩散平衡，且核膜对DRK具有高度通透性。细胞核内存在完全不同的区域——部分区域仅允许蛋白质发生与时间成正比的均方位移扩散重分布，而其他区域的蛋白质移动性似乎受到限制。光开关后，细胞核内观察到浅色DRK分子呈现线状分布模式，另有部分DRK分子呈现静止状态。这些发现支持了将细胞内部分为随机障碍模型并包含静止DRK组分的新理论。数值模拟表明：尽管扩散常数存在显著差异，在不同光照强度和距激光焦点不同距离条件下仍可能获得相似的荧光恢复模式。
关键词： 随机游走、荧光显微镜、扩散常数、纳米流体学、三重奏（Dreiklang）、超分辨率显微镜、荧光蛋白、光开关分子
更新于2025-09-16 10:30:52