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利用可见光响应性肽骨架光开关调控蛋白质-蛋白质相互作用
摘要： 生命依赖于一系列精心协调的过程，其中蛋白质及其直接相互作用最终决定了细胞功能和疾病发生。近年来，对这些复杂互作的调控引起了关注，甚至被视为一种新型治疗策略。本文我们描述了两种基于偶氮苯衍生物的可见光响应肽骨架光开关的合成与表征，用于实现对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的光学控制。这种新型拟肽分子在交替蓝/绿光照射循环下能快速异构化并具有可逆性，且光化学疲劳度低。两者均以纳摩尔级亲和力结合目标蛋白。值得注意的是，最佳拟肽异构体在蛋白结合能力上表现出显著差异，进而通过破坏PPI抑制酶活性的潜力也有所不同。此外，晶体结构测定、分子对接和分子动力学计算提供了分子层面的解释，为未来光控PPI调节剂的设计与合成开辟了新途径。
关键词： 蛋白质-蛋白质相互作用、光药理学、可见光照射、偶氮苯、光开关
更新于2025-11-21 11:20:42
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通过改进的FRET/FLIM分析方法测量活细胞中转录因子Nrf2与其负调控因子Keap1的相互作用
摘要： 转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）及其主要负调控蛋白Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）构成了一套分子效应与传感系统，通过协调全面的细胞保护程序，对细胞氧化还原稳态的扰动作出强效响应。在稳态条件下，Nrf2是一种短寿命蛋白，会被靶向泛素化及蛋白酶体降解。当遇到亲电试剂、氧化剂或促炎刺激时，Keap1中的半胱氨酸传感器会发生化学修饰，导致其无法靶向降解Nrf2，进而使该转录因子积累并增强细胞?；せ虻淖?。虽然通过多种体外系统已深入解析了Nrf2与Keap1的蛋白互作关系，但能在活细胞环境中评估这些互作的检测方法却很少。我们先前开发了基于成像的FLIM/FRET技术来可视化和测量单细胞中Nrf2与Keap1的相互作用。本研究旨在改进该方法以提高通量与精度，并降低细胞间差异性。为消除方向偏倚可能性，我们在Keap1与FRET受体荧光蛋白标签间引入了柔性连接肽；为确保Nrf2-FRET供体荧光蛋白标签的正确成像，采用sfGFP作为FRET供体使其成熟时间与内源性Nrf2半衰期匹配。全局分箱法提升了检测通量，而分析过程中纳入实测仪器响应函数则提高了精度。应用该方法发现结果与受体表达水平存在强共变关系，通过考虑受体水平可规避细胞间差异性，从而增强活细胞中Keap1-Nrf2相互作用测量的灵敏度。
关键词： FRET（荧光共振能量转移）、活细胞成像、荧光寿命、FLIM（荧光寿命成像显微镜）、sfGFP（超折叠绿色荧光蛋白）、蛋白质-蛋白质相互作用、全局合并、Keap1（Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1）、仪器响应函数、Nrf2（核因子E2相关因子2）
更新于2025-11-21 11:08:12
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通过静态光散射研究高浓度单克隆抗体溶液的蛋白质-蛋白质相互作用及其对粘度的影响
摘要： 设计和配制单克隆抗体（mAb）以减少高浓度下的吸引相互作用，对蛋白质加工、稳定性和给药（尤其是皮下注射时常见的高粘度挑战）至关重要。通过静态光散射（SLS）测定了IgG1和IgG4单克隆抗体从低到高浓度下的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）强度，并据此解析粘度数据。采用NaCl和五种有机离子共溶剂调节PPI强度。基于SLS数据，通过归一化结构因子S(0)/S(0)HS和Kirkwood-Buff积分G22/G22,HS（HS=硬球模型）量化PPI强度，同时采用（1）球形Yukawa势和（2）相互作用硬球（IHS）模型（通过假设寡聚体描述吸引力）进行拟合。对于相互作用更强的体系（mAb和/或共溶剂），IHS模型比球形Yukawa势更能准确捕捉散射行为。针对每种PPI表征指标，在给定mAb的高浓度（200 mg/mL）粘度与低浓度（20 mg/mL）及同浓度（200 mg/mL）的相互作用强度之间均呈现线性关联。但唯一能跨两种mAb建立相关性的参数是IHS模型中的寡聚体质量比（moligomer/mmonomer+dimer），这表明自缔合作用（除吸引性PPI的直接影响外）对粘度具有重要影响。
关键词： 蛋白质-蛋白质相互作用、静态光散射、共溶质、单克隆抗体、粘度、相互作用硬球模型、汤川势
更新于2025-09-23 15:23:52
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基于表面等离子体共振技术在植物发育及相关过程研究中的最新进展
摘要： 自20世纪90年代初问世以来，表面等离子共振技术（SPR）已成为研究蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质、蛋白质-碳水化合物、蛋白质-RNA及蛋白质-脂质等广泛生物分子相互作用特异性、亲和力及实时动力学的重要工具。该技术为植物发育各环节伴随的分子互作机制提供了关键信息。多种凝集素的结构-功能关系取决于其单体四聚体排列方式。利用SPR技术，植物激素研究取得新发现：在拟南芥中鉴定出新型水杨酸结合蛋白（SABPs），包括α-酮戊二酸脱氢酶E2亚基、谷胱甘肽S-转移酶、寡肽酶TOP2/TOP1以及GAPDH蛋白家族成员。通过将生物素标记的DELLA肽段固定在传感器芯片上，以AtGID1a（赤霉素受体）为分析物，观察到GA4能显著增强DELLA与GID1的结合。分子印迹单层修饰的SPR检测法可精准区分IAA、IBA和KT等相似植物激素，检测限达亚皮摩尔级。研究表明CORONATINE INSENSITIVE 1（COI1）是茉莉酸受体。SPR生物传感器能检测低至最小致死剂量（200 ng/ml）2500分之一的蓖麻毒素。对病毒蛋白（VirE1/VirE2）与单链DNA的实时结合动力学研究显示，其结合受底物影响显著，且仅发生在poly T序列而非poly A或双链DNA上?；乒匣邓阑ㄒ恫《荆–NV）复制酶蛋白p93与宿主分子伴侣Hsp70的相互作用揭示了Hsp90在病毒复制酶组装中的潜在作用。通过植物化学小分子库的SPR分析，发现鞣花单宁类化合物geraniin是对Hsp90（多种癌蛋白稳定剂）最具抑制活性的成分之一。未来SPR技术的应用将为植物发育及相关过程的分子机制研究提供重要突破。
关键词： 蛋白质-伴侣蛋白相互作用、蛋白质-碳水化合物相互作用、植物病毒、表面等离子体共振、植物激素、蛋白质-核酸相互作用、外源物质、蛋白质-蛋白质相互作用
更新于2025-09-23 15:21:01
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近红外光通过上转换光遗传学纳米系统以时空精准度远程上调自噬
摘要： 通过生物安全的近红外（NIR）光无创调控生物功能的方法正日益受到关注。上转换稀土纳米材料作为新型光子元件，在这些应用中展现出巨大潜力，已被广泛应用于光遗传学领域。本文设计了一种能实现时空精准调控自噬的上转换光遗传学纳米系统：该生物相容性系统由两部分构成——用于导入的蓝光受体光遗传学-自噬上调质粒，以及封装柔性胶囊的上转换棒（可将组织穿透性NIR光转化为局部可见蓝光）。实验验证该系统能在体外（HeLa和293T细胞系）实现自噬上调，并在活体内远程穿透组织（约3.5毫米）。鉴于自噬在细胞内信号通路中的核心地位及其与多种病理的关联性，该方法有望建立基于上转换材料的自噬上调策略，应用于基础研究与临床实践。
关键词： 光遗传学、自噬、上转换材料、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、近红外光（NIR）
更新于2025-09-24 01:16:31
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光笼化醌甲基化物交联剂用于蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA复合物的光控化学交联
摘要： 小分子交联剂对于探究生物分子相互作用及解决大蛋白质复合物和固有无序蛋白的交联质谱（CXMS）研究具有不可替代的价值。现有化学交联剂仅靶向少量特定氨基酸残基，限制了交联数量与类型；而传统光交联剂虽能非选择性地靶向几乎所有残基，却使数据分析复杂化。本研究报道了基于光笼醌甲基化物（PQM）的交联剂，其通过特异性迈克尔加成反应可同时靶向九种亲核残基。除天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸外，PQM交联剂还能靶向谷氨酰胺、精氨酸和天冬酰胺——这些是目前化学交联剂无法作用的残基，显著提升了单一交联剂的靶向范围。此类多重交联特性将增加CXMS鉴定中交联肽段的丰度，并为结构解析提供充分约束条件。该PQM交联剂已在体外、大肠杆菌及哺乳动物细胞中成功用于二聚体蛋白与内源膜受体的交联。其中NHQM交联剂还能直接实现蛋白与DNA的交联——目前具备此功能的交联剂极少。这些具有光激活特性与多靶点反应活性的PQM交联剂，将大幅提升基于化学交联技术在蛋白质-蛋白质/蛋白质-DNA网络研究及结构生物学领域的应用效能。
关键词： DNA-蛋白质相互作用、交联剂、蛋白质-蛋白质相互作用、光交联、甲氧基醌
更新于2025-09-19 17:13:59
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荧光氨基酸探针揭示LexA与激活态RecA相互作用的动力学及分子基础
摘要： 细菌DNA损伤应答（SOS应答）是抗生素逃逸的关键通路，也是对抗获得性抗生素耐药性的重要靶点。该应答的激活由两种蛋白质调控：阻遏蛋白LexA和DNA损伤传感器RecA。DNA损伤后，RecA与LexA的直接相互作用导致SOS应答去抑制。然而，这种相互作用的确切分子机制尚不明确。本研究采用荧光非天然氨基酸吖啶基丙氨酸（Acd）作为大肠杆菌RecA:LexA复合物的低干扰探针。通过标记Acd的LexA，我们首次建立了LexA与激活态RecA可逆结合的动力学模型。研究还阐明了LexA特定氨基酸截短或替换对RecA:LexA结合强度的影响，并证实编码LexA残基75-84的移动环构成了RecA的关键识别界面。除揭示SOS激活机制外，该方法进一步确立了Acd作为研究其他复杂系统中蛋白质相互作用动态的灵敏荧光探针。
关键词： SOS反应、荧光氨基酸探针、RecA、LexA、蛋白质-蛋白质相互作用
更新于2025-09-19 17:13:59
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利用手性等离子体纳米结构探测蛋白质-蛋白质相互作用的特异性
摘要： 蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在许多生物过程中起着关键作用。因此，区分由特异性相互作用形成的功能重要的结构明确的蛋白质-蛋白质复合物与由非特异性相互作用产生的随机聚集体是一项至关重要的能力。虽然有许多技术可以快速筛选PPIs中的结合亲和力，但没有一种通用的光谱现象能够快速表征蛋白质-蛋白质复合物的结构。在本研究中，我们展示了手性等离子体场如何探测结构有序性，从而反映模型抗体-抗原系统中PPI特异性的水平。通过使用表面固定化的、对牛血清白蛋白（BSA）具有高特异性的多克隆兔IgG抗体的Fab′片段，我们证明手性等离子体场能够区分结构各向异性的BSA-Fab′复合物集合与随机的卵清蛋白（OVA）-Fab′聚集体，展示了其作为蛋白质组学技术基础的潜力，可用于PPIs的初步快速高通量筛选。
关键词： 特异性、蛋白质-蛋白质相互作用、结构有序性、手性等离子体纳米结构、高通量筛选
更新于2025-09-16 10:30:52
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光笼化醌甲基化物交联剂用于蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA复合物的光控化学交联
摘要： 小分子交联剂对于探究生物分子相互作用及在交联质谱（CXMS）中解析大蛋白质复合物和固有无序蛋白具有不可替代的价值。现有化学交联剂仅靶向少数特定氨基酸残基，限制了交联数量与类型；而传统光交联剂虽能非选择性地靶向几乎所有残基，却使数据分析复杂化。本研究报道了基于光笼醌甲基化物（PQM）的交联剂，其能通过特异性迈克尔加成反应同时靶向九种亲核残基。除天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸外，PQM交联剂还能有效交联谷氨酰胺、精氨酸和天冬酰胺——这些残基此前无法被现有化学交联剂靶向，显著提升了单一交联剂的残基覆盖范围。此类多重交联特性将增加CXMS鉴定中交联肽段的丰度，并提供充足的结构约束以辅助结构解析。我们成功将该交联剂应用于体外体系、大肠杆菌及哺乳动物细胞中二聚体蛋白与内源膜受体的交联实验。其中NHQM交联剂可直接实现蛋白与DNA的交联——此类功能交联剂此前极少存在。PQM交联剂的光激活特性与多重靶向反应性，将大幅提升基于化学交联技术在蛋白质-蛋白质/蛋白质-DNA网络研究及结构生物学领域的应用效能。
关键词： 醌甲基化物、光交联、DNA-蛋白质相互作用、交联剂、蛋白质-蛋白质相互作用
更新于2025-09-11 14:15:04
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利用荧光标记焦点法同步检测全细胞中p53:Mdm2与p53:Mdm4蛋白相互作用
摘要： 本报告描述了一种荧光蛋白-蛋白相互作用可视化技术（FLUOPPI）的开发，该技术可同步检测Mdm2:p53与Mdm4:p53两种相互作用，从而评估p53肽螺旋模拟分子对这两种蛋白相互作用的相对抑制效率。Mdm2和Mdm4的过表达常通过抑制非突变型p53的转录活性、增强其被蛋白酶体降解或阻止其核内转运，导致人类癌症中p53失活?？⒛芷苹灯渲幸恢只蛄街值鞍紫嗷プ饔玫囊种萍?，已成为抗癌药物研发的重点领域。通过双模态FLUOPPI系统，我们表征了针对Mdm2单特异性或同时靶向Mdm2/Mdm4双特异性的化合物，并证明该检测方法能通过精确评估及测量细胞群的标准化处理，可靠区分对这些蛋白复合物的特异性与非特异性破坏。该方法有望提高筛选效率——既能从密切相关的相互作用家族中筛选针对单一PPI的特异性化合物，也能筛选作用于多个相关PPI对的广谱化合物，具体取决于实际需求偏好。
关键词： Mdm4、Mdm2、蛋白质-蛋白质相互作用、癌症治疗、FLUOPPI、p53
更新于2025-09-11 14:15:04